Endozytose und intrazelluläres Trafficking von Lektin-B-Ketten-funktionalisierten Liposomen
Final Report Abstract
Es war geplant, an verschiedenen Zellen die Aufnahme der B-Kette des MLI zu untersuchen. Hierbei waren zunächst COS-7 Zellen (Affennieren- Carcinomzellen), Endothelzellen (HAEC oder HUVEC), bzw. Kelly-Zellen zu verwenden. Es schien aber nach einigen Vorversuchen sinnvoll, zunächst das eigentlich Ziel, die mögliche Endozytose über den Caveolaeweg in Abgrenzung zum Clathrin-vermittelten Weg ins Auge zu fassen. Hierfür sind besonders die MDCK II- und A-10-Zellen waren hier besonders geeignet. Mit diesen Zellen wurde sehr eingehend untersucht, wie das gesamte Mistellektin MLI und seine isoliere B-Kette dabei mit den Zellen interagieren. Dabie wurden zwei unabhängige Chargen des ML! Und der B-Kette untersucht, die beide das gleiche Ergebnis zeigten. 1. Zunächst zeigte sich, dass die beiden Proteine in den verwendeten Konzentrationen, für die die Aufnahme untersucht wurde, nicht zelltoxisch sind. 2. Die Assoziation von MLI und der B-Kette an die Zellen in durchflusszytometrischen Untersuchungen bei 37 °C war zeitabhängig. Dies war für die MDCK II-Zellen besonders ausgeprägt. Dies deutet auf eine zeitabhängig Exozytose oder Desorption über Transportproteine (z.B. P-Glykoprotein) hin. 3. Zur Unterscheidung, ob Clathrin- oder Caveolae-vermittelte Endozytose vorliegt, wurden spezifische Hemmstoffe dieser Wege eingesetzt, die jedoch alle keine Verminderung der Assoziation bewirkten. Der vermutete Caveolae-Weg konnte also nicht verifiziert werden. 4. Genauere Untersuchungen der Assoziation auch bei 4 °C deuten auf eine vorwiegend Energie-unabhängige Assoziation vor allem der B-Kette an beide Zelllinien hin. Dies legt eine starke Adsorption der B-Kette an die Plasmamembran der Zellen ohne aktive Aufnahme ins Zellinnere nahe. Dies wurde durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen (Gesamtaufnahme mit SpectraCube und „Zellschnitte“ mit konfokaler Mikroskopie) untermauert. Im Gegensatz dazu zeigt das gesamte Mistellektin MLI eine temperaturabhängige Zellaufnahme über einen aktiven Prozess, der zumindest bei A-10-Zellen (unerwarteter Weise) leicht vermehrt über Caveolae-vermittelte Endozytose läuft. Dies könnte auf eine Bevorzugung der Cavelae-Endozytose auch in Clathrin-dominanten Zellen durch das Gesamtprotein MLI hinweisen. Fazit: Das völlige Fehlen eines aktiven Transportprozesses der isolierte B-Kette des Mistellektins ist ein überraschender Befund. Bisher wurde davon ausgegangen, dass die A- Kette der zelltoxische Teil und die B-Kette der Teil des Lektins ist, der für die Aufnahme in die Zelle verantwortlich ist. Nach unseren Ergebnissen vermittelt die B-Kette des Lektins wahrscheinlich eine unspezifische Bindung an die Plasmamembran von Zellen, anschließend erfolgt die Aufnahme des Lektins in die Zellen über einen Weg, den wir noch nicht genauer charakterisieren konnten. Hier werden wir weitere Untersuchungen durchführen. Nach diesen Befunden konnte aber das Ziel einer spezifischen Caveolae-vermittelten Endozytose von Liposomen nicht weiter verfolgt werden. Es ist aber mit den gezeigten Untersuchungen prinzipiell möglich mit Liposomen, an die die B-Kette gekoppelt ist eine starke unspezifische Bindung von Liposomen an Zellen zu erreichen. Ob dabei die Liposomen an unterschiedliche Zellen verschieden stark binden, ist Ziel weiterführender zukünftiger Untersuchungen.
