Entwicklung und Einsatz innovativer Bioreaktorsysteme für die Darstellung von Knochengewebe
Final Report Abstract
Dieses Projekt wurde über einen Zeitraum von drei Jahren von der DFG gefördert und beschäftigte sich mit den Auswirkungen mechanischer Stimulation und dynamischer Kultivierung auf die osteogene Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen. Es ist in vier Teilabschnitte (Workpackages) untergeteilt, die nacheinander bearbeitet wurden. Ziel des ersten Arbeitspaketes war, die vorhandenen Dehnungsapparaturen zu modifizieren und den Drehbettreaktor so umzubauen, dass eine online Analytik möglich ist. Der Prototyp der Dehnungsapparaturen konnte erfolgreich umgebaut werden, sodass nun 10 Apparaturen parallel betrieben werden können. Dafür wurde eine neue Software entwickelt, sodass jede Apparatur einzeln steuerbar ist. Darüber hinaus wurden die Apparaturen mit pH und O2 Sensoren ausgestattet, um eine Überwachung des Mediums zu gewährleisten. Der Drehbettreaktor wurde mit einer eigenen Steuereinheit ausgestattet, die sowohl die Medium zu- und abfuhr, als auch die gesamte Überwachung des Mediums und der Gasphase regelt. Damit sind eine Änderung der Medienzusammensetzung und die der Gasphase jederzeit möglich. Desweiteren wurde für den Drehbettreaktor eine eigene beheizbare Sterilwerkbank angeschafft und angepasst, in der eine sterile Probenahme jederzeit möglich ist. Der Drehbettreaktor wurde außerdem während der Projektphase gegen einen disposable Reaktor (ZR®PD) umgebaut, bei dem auch eine interne Besiedlung der Keramiken mit Zellen möglich ist. Dieser disposable Reaktor wurde ebenfalls umgebaut und angepasst, sodass eine periodische Druckbelastung im Reaktor möglich ist. Das zweite Arbeitspaket diente zur Etablierung der Kultivierungsbedingungen in den Dehnungsapparaturen und im Drehbettreaktor unter Einsatz von Zelllinien. Als Modellzelllinien dienten MC3T3, MG-63 und SaoS-2 Zellen. MG-63 und SaoS-2 Zellen sind humane osteosarkome Knochenzelllinien, bei MC3T3 Zellen handelt es sich um Mausfibroblasten. Alle drei Zelllinien können osteogen differenziert werden. Die MG-63 Zellen wurden in den Silikonschalen mechanisch gedehnt. Dabei wurden unterschiedliche Muster von kurzer einmaliger (15 Minuten) bis zu mehrmaliger Stimulation (8 h) durchgeführt, um herauszufinden, welchen Einfluss der Zeitraum der Stimulation auf die osteogene Differenzierung hat. Desweiteren wurden in diesem Arbeitspaket MC3T3 Zellen zunächst mechanisch stimuliert und anschließend auf einer keramischen 3D Struktur kultiviert. Im Anschluss wurde die Viabillität der Zellen mittels MTT-Test bestimmt. Um die optimalen Kultivierungsbedingungen im Drehbettreaktor zu etablieren und, wurden SaoS-2 Zellen auf Sponceram® und Sponceram® HA besiedelt und in dem Bioreaktor dynamisch kultiviert. Der dritte Teilabschnitt beinhaltet die gesamte Entwicklung und Etablierung der analytischen Methoden mit denen die Zellen nach den Experimenten untersucht werden sollten. Die Viabilität der Zellen nach den Dehnungsversuchen wurde mit Hilfe von MTT Tests überprüft. Das Wachstum der Zellen im Bioreaktor wurde anhand von Glucose/Laktat Messungen während der Kultivierungen nachvollzogen. Die Aktivität der Alkalischen Phosphatase, einem Enzym, das in der frühen Osteoblastenreifung produziert wird, wurde im Kulturmedium mittels Messung der optischen Dichte bestimmt. Um die Expression knochenspezifischer Marker nachzuweisen, wurde nach den Experimenten die RNA der Zellen isoliert, die mRNA in cDNA umgeschrieben und RT-PCR durchgeführt. Mit spezifischen Färbereaktionen wurde nach den Kultivierungen im Bioreaktor die Einlagerung von Calcium in die extrazelluläre Matrix nachgewiesen. Mit Hilfe der DNA-Chip Technologie sollten die Expressionsprofile der Zellen nach den unterschiedlichen Experimenten erfasst werden. Problematisch ist die Bereitstellung der für die Analyse benötigte Zellmenge. In den Silikonschalen ist die Anzahl der Zellen so gering, dass nicht genügend Zellen für eine solche Analyse zur Verfügung stehen. Auf den Keramiken, die in dem Bioreaktor kultiviert wurden, war die Zellzahl zwar deutlich höher, aber nach der Kultivierung hatten die Zellen so viel extrazelluläre Matrix gebildet, dass nur ein Bruchteil der Zellen durch ein enzymatisches Ablösen von den Keramiken gelöst werden konnten. Um die Zellen auf den Keramiken in einer dreidimensionalen Form zu visualisieren, wurden µCT Aufnahmen nach den Kultivierungen im Bioreaktor durchgeführt. Dabei stellte sich heraus, dass das Sponceram® selber ein hohes Hintergrundsignal besitzt, sodass die Zellen auf den Keramiken nicht sichtbar gemacht werden konnten. Daher wurden REM (Raster Elektronen Mikroskop) Aufnahmen von den Zell-Keramik Konstrukten aufgenommen, um die Zellverteilung auf dem Sponceram® zu visualisieren. Im vierten Teil sollten schließlich die gesamten Experimente mit zwei verschiedenen Typen primärer Zellen durchgeführt werden. Dafür wurden mesenchymale Stammzellen aus dem Fettgewebe und der Whartonschen Sulze der Nabelschnur verwendet. Ursprünglich sollten Stammzellen aus dem Knochenmark verwendet werden. Allerdings ist die osteogene Differenzierung dieser Zellen schon sehr gut untersucht und die Verfügbarkeit dieser Zellen ist limitiert. Desweiteren besteht am Institut für Technische Chemie mittlerweile die Möglichkeit in Zusammenarbeit mit der Frauenklinik der MH Hannover, Stammzellen aus der Nabelschnur selber zu isolieren. Daher wurden die gesamten Dehnungsexperimente und die Kultivierungen im Drehbettreaktor mit den Stammzellen aus dem Fettgewebe und der Nabelschnur durchgeführt. Dabei konnte für beide Zelltypen eine osteogene Differenzierung nachgewiesen werden.
Publications
- GSZ 2006: Adipose tissue derived stem cells for bone tissue engineering
S. Diederichs, C. Kasper, S. Kall, T. Scheper, M. van Griensven
- TERMIS 2006 Mechanical straining of adipose tissue derived mesenchymal stem cells for application in bone tissue engineering
S. Diederichs, S. Kall, H. Hoffmeister, M. Wieland, C. Kasper, T. Scheper, M. van Griensven
- Cultivating cells of different origin for 3d bone constructs considering physiological conditions. In Cell Technology for Cell Products, Verlag Springer Niederlande, 2007
K. Suck, C. Kasper, C. Hildebrandt, S. Diederichs, M. Fischer, T. Scheper, M. van Griensven
- ESACT 2007: Investigation of the effect of mechanical strain on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells
S. Diederichs, D. Riechers, F. Sempf, S. Kall, C. Kasper, M. van Griensven, T. Scheper
- European BioPerspectives 2007: Mechanical stimulation of adipose tissue derived mesenchymal stem cells for bone tissue engineering
S. Diederichs, S. Kall, C. Kasper, M. van Griensven, T. Scheper
- GSZ 2007: Mechanical stimulation of adipose tissue derived mesenchymal stem cells
S. Diederichs, D. Riechers, B. Weyand, C. Kasper, T. Scheper, M. van Griensven
- TERMIS 2007: Dynamic mesenchymal stem cell culturing for bone tissue engineering
S. Diederichs, D. Riechers, F. Sempf, C. Kasper, T. Scheper, M. van Griensven
- Bone Tec 2008: Osteogenic differentiation of MG-63 cells induced by mechanical strain in a three dimensional collagen scaffold
S. Böhm , Solvig Diederichs, Stefanie Röker, Martijn van Griensven, Thomas Scheper, Cornelia Kasper
- European Bioperspective 2008: Effects of mechanical stimulation concerning the osteoblastic differentiation
S. Böhm, S. Diederichs, C. Kasper, M. van Griensven, T. Scheper
- TERMIS 2008: Mechanical stimulation of an osteoblastic cell line on a three-dimensional collagen scaffold
S. Böhm , Solvig Diederichs, Martijn van Griensven, Thomas Scheper, Cornelia Kasper
- Bone Tec 2009: Mechanical Stimulation of human mesenchymal stem cells for bone Tissue Engineering
S. Böhm, S. Diederichs, B. Suvandzhieva, T. Scheper, M. van Griensven, C. Kasper
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S. Diederichs, S. Röker, D. Marten, A. Peterbauer, T. Scheper, M. van Griensven, C. Kasper
(See online at https://doi.org/10.1002/btpr.258) - ESACT 2009: Online measurement of pH and O2 values during mechanical stimulation of cells
S. Böhm , Solvig Diederichs, Martijn van Griensven, Thomas Scheper, Cornelia Kasper
- Novel 3D biomaterials for tissue engineering based on collagen and macroporous ceramics. 2009, 40, No. 1 – 2
S. Röker, S. Diederichs, Y. Stark, S. Böhm, I. Ochoa, J. A. Sanz, J. M. Garcia-Aznar, M. Doblare, M. van Griensven, T. Scheper, C. Kasper
- Application of different strain regimes in two-dimensional and three-dimensional adipose tissue derived stem cell cultures induce osteogenesis; implications for bone tissue engineering. Journal of Biomedical Material Research Part A
S. Diederichs, S. Böhm, A. Peterbauer, C. Kasper, T. Scheper, M. van Griensven
- Bone Tec 2010: Osteogenic Differentiation of Primary stem cells with BMP-2 in a rotating bed reactor
S. Böhm, S. Böhm, Y. Upu, T. Scheper, M. van Griensven, M. Machluf, C. Kasper
