Searching for transport proteins for TRIAC or DITPA acting as T3/TH substitutes.
Final Report Abstract
Schilddrüsenhormone (TH) sind essentiell für Wachstum, Metabolismus und Entwicklung, insbesondere des zentralen Nervensystems. Eine verringerte Verfügbarkeit des TH T3 (3,3`,5-triiodo-L-Thyronin) im Gehirn während der Entwicklung führt zu einer schweren mentalen Retardierung (Allan-Herndon-Dudley Syndrom, AHDS). TH benötigen auf dem Weg zu ihren Zielproteinen, den nukleären Schilddrüsehormon-Rezeptoren (TR) im Zellkern, Transmembrantransporter-Proteine für die Überwindung der Zellmembranen. Von den bisher bekannten TH-Transmembrantransportern ist der Monocarboxylat Transporter 8 (MCT8) der einzige TH spezifische. AHDS wird durch unterschiedliche pathogene Mutationen des humanen MCT8 und das daraus folgende T3-Defizit im Nervensystem ausgelöst. Im Gegensatz zu THs wird das SDH-Analoga TRIAC (3,5,3'-Triiodothyroessigsäure) nicht über den MCT8 transportiert und erreicht auch bei MCT8-Defizienz die, im Zellkern lokalisierten, TR und aktiviert diese. Daher hat TRIAC klinisches Potential zur pharmakologischen Intervention bei TH-Krankheiten wie dem AHDS. Das Hauptziel dieses Projekts war die Identifizierung von Transmembrantransport-Proteine für TRIAC. Hierzu wurde ein Hoch Durchsatz „small interfering RNA“ (siRNA) Screen mit einer das gesamte Menschliche Genome umfassenden siRNA-Bibliothek entwickelt und durchgeführt. Zunächst wurden verschiedene stabile TR-Reporter Zelllinien basierend auf einem optimierten TR-transaktivierten Luciferase-Reportergens generiert und ein TR-Reporter Assay für das 96-Well Platten- und 384-Well Plattenformat etabliert. Das Grundprinzip des siRNA-Screens basiert darauf, dass durch Knockdown der transportrelevanten Transmembrantransport-Proteine mittels siRNAs die Aufnahme des TH-Analogs TRIAC in die Zelle und damit die TR Aktivierung verhindert wird. Durch das Luciferase-Reportergen kann somit ein relevantes Gen mit dem Ausbleiben des Biolumineszenz-Signals verknüpft werden. Von initial 18090 Genen der humanen Genom-Bibliothek wurden über mehrere Screeningund Validierungs-Runden die Anzahl der potentiellen TRIAC-Transporter von initial 1512, schrittweise auf 126, 53 und 13 auf letztendlich drei Kandidaten SLC22A9, SLC29A und ABCD1 eingeschränkt. Mit diesen wurden initiale Charakterisierungen des Substratspektrums begonnen. Die Kenntnisse Molekularer Transportmechanismen für TH Analoga wie TRIAC ermöglichen weitergehende Studien zur pharmakologischen Beeinflussung von Fehlfunktionen von Schilddrüsenhormonen. Zusätzlich zeigte die für den hoch-durchsatz Screen entwickelte äußerst robuste TR-Reporter Zelllinie K11 mit einer EC50 für T3 von ~220 pM (95% Konfidenzintervall; 203 pM bis 255 pM) und einer detektionsgrenze von 5 pM T3 und einem schnellen Read-Out nach 4-5 Stunden äußerst interessante Eigenschaften. Diese wurden zur Detektion und Quantifizierung von durch 3D-Thyroid-Organoid produzierte THs eingesetzt und könnte eine wichtige Rolle bei Studien von Endokrinen-Disruptoren in Organ-On-a-Chip Modellen spielen.
Publications
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Krause G, Hinz KM
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