Plasticity of microcircuits in the mushroom body calyx of insects
Final Report Abstract
Ziel des Projekts war es, grundlegende Prinzipien neuronaler Strukturplastizität in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster und der Honigbiene Apis mellifera zu erforschen. Zelluläre Komponenten synaptischer Komplexe zweier Neuropile, der Lamina (erstes optisches Neuropil) und dem Pilzkörper (höheres sensorisches Integrationszentrum), wurden untersucht. Dendriten von L2 Laminazellen sowie von Kenyonzellen im Pilzkörper wurden mittels konfokaler Lasermikroskopie (CLSM) und Elektronenmikroskopie (TEM) visualisiert. Das Identifizieren geeigneter Fliegenlinien zur Visualisierung von Dendriten (Dimension ~2 µm) war sehr zeitund sehr arbeitsintensiv. Nach Etablierung geeigneter Protokolle zur Visualisierung dendritischer Spines und Screening mehrerer UAS-Fliegenlinien konzentrierte ich mich auf zwei Fragen: 1.) Beeinflussen Alter, Genotyp und visuelle Deprivation die dendritischen Dornen von L2? 2.) Basieren im Pilzkörper beschriebene altersabhängige Volumensveränderungen auf Strukturveränderungen der Kenyonzelldendriten? Zu 1. Beeinflussen Alter, Genotyp und visuelle Deprivation die dendritischen Dornen der L2- Laminazellen von Drosophila melanogaster? L2 Zellen in der Lamina haben schlanke dendritische Dornen und sind aufgrund ihrer Größe schwer zu visualisieren und zu quantifizieren. 21D-Gal4 diente als Driver Line, um Green- Fluorescent-Protein (GFP) spezifisch in L2-Laminazellen zu exprimieren. Nur zwei der getesteten Effektorlinien, die in Neuritenmotilitaet bzw. f-Aktinmobilisierung involviert sind, zeigten eindeutige dendritische Dornen: UAS-LimK-GFP und UAS-mCD8-GFP. Diese Studie zeigt, dass alle drei untersuchten Parameter (Alter, Genotyp und visuelle Deprivation) die Morphologie der dendritischen Dornen von L2 in der F1-Generation von 21D-Gal4 x UAS-LimK sowie von 21D-Gal4 x UAS-mCD8 beeinflussen. 1) Dendritische Dornen fünf Tage alter Fliegen (aufgezogen im Tag-/Nacht-Rhythmus) sind dünn, am Ende meist verzweigt und kontaktieren konkret ihre presynaptischen Partner. 2) In Fliegen mit Überexprimierung von f-Aktin ist das Pruning der L2-Neuriten sowie das spezifische Kontaktieren dieser an ihre presynaptischen Partner erschwert. 3) In fünf Tage alten, visuelle deprivierten Fliegen sind die dendritischen Dornen von L2 dick und wenig verzweigt vermutlich aufgrund der fehlenden aktivitätsabhängigen Formung der dendritischen Dornen. Zu 2. Basieren im Pilzkörper beschriebene altersabhängige Volumensveränderungen auf Strukturveränderungen der Kenyonzelldendriten von Drosophila melanogaster? Das Pilzgift Phalloidin wurde bereits im ZNS in vielen Tierarten als spezifischer Marker für f- Aktin angewendet. Markierung der postsynaptischen Seite von synaptischen Komplexen, sogenannter Mikroglomeruli (MG), im Pilzkörper (PK) visualisiert in der Honigbiene distinkte und in der Fruchtfliege (Oregon R) verschwommene F-Aktinringe. Phalloidin ist daher als Marker für synaptische Komplexe und deren Untersuchung auf altersabhängige Plastizität im PK Calyx von Drosophila ungeeignet. Dasselbe gilt für den f- Aktin-spezifischen Antikörper ab205 (Firma: abchem). OK107-Gal4 diente als Driver Line, um GFP spezifisch in allen Kenyonzellen zu exprimieren. UAS-actin-GFP unter der Kontrolle von OK107-Gal4 visualisierte g- und f-Aktin und ist daher als Effektorlinie für die Quantifizierung von MGs ungeeignet. LimK-GFP unter der Kontrolle von OK107-Gal4 visualisierte individuelle, in ihrer Größe inhomogene MGs. In frisch geschlüpften Fliegen lässt sich eine Anzahl von 1500 MGs pro Calyx (n=10) quantifizieren. Diese Anzahl steigt in den ersten 10 Tagen auf eine Anzahl von 2300 MGs pro Calyx (n=10) signifikant an. Es gelang bisher nicht in Kontrolltieren ohne f-Aktinüberexprimierung die Anzahl von synaptischen Komplexen als Referenz zu quantifizieren. Im Wildtyp Oregon R wurden serielle EM-Schnitte im PK Calyx entlang einer Tiefe von 25µm angefertigt und einzelne Projektionsneurone, deren aktive Zonen und kontaktierende dendritische Dornen werden derzeit rekonstruiert. Überraschungen im Projektverlauf: Vor Antritt meines Auslandsaufenthaltes in Halifax fixierte ich Bienengehirne unterschiedlicher Altersstufen beider weibliche Kasten für TEM, um die f-Aktinverteilung in Dendriten von L2-Laminazellen und von Kenyonzellen auf ultrastruktureller Ebene zu untersuchen. Obwohl die Präparate nach Protokollen des Meinertzhagen-Labors angefertigt wurden, zeigten Semidünnschnitte mangelnde Gewebefixierung. Ursache hierfür liegt vermutlich an der unterschiedlichen Dichte bzw. Dicke des neuronalen Gewebes bei der Honigbiene im Vergleich zu Drosophila. Die Experimente werden im Rahmen einer Kooperation wiederholt.
