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Projekt
Verwendung humaner Stammzellmodelle zur Charakterisierung von Glykosylierungsdefekten
Antragsteller
Professor Dr. Falk Büttner
Fachliche Zuordnung
Entwicklungsbiologie
Biochemie
Biochemie
Förderung
Förderung seit 2017
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 289991887
Drei ER-abhängige Glykosylierungswege, N-Glykosylierung (N-Glyko), C-Mannosylierung (C-Man) und O-Mannosylierung (O-Man) verwenden den aktivierten Donor-Zucker Dolicholphosphat-Mannose (Dol-P-Man), dessen Biosynthese aus Mannose über Man-6-P, Man-1-P und GDP-Mannose erfolgt. Hypomorphe Mutationen der Phosphomannomutase 2 (PMM2), welche die Isomerisierung von Man-6-P zu Man-1-P katalysiert, verursachen ein schweres Krankheitsbild, das als PMM2-CDG bezeichnet wird. Klinisch stellt sich PMM2-CDG multisystemisch dar, wobei neurologische Defekte und Defekte in der Herstellung von Leber-abgeleiteten Serumproteinen allen Patienten gemeinsam sind. Studien zur Ätiologie von PMM2-CDG waren bislang auf die Analyse des N-Glykosylierungsweges fokussiert. Da Dol-P-Man jedoch auch für C- und O-Man essentiell ist, ist die Erweiterung der Analysen auf diese Wege dringend geboten. Unterstützend für diese Aussage sind Nachweise, dass O-Man (z.B. E-Cadherin) und C-Man (z.B. Zytokinrezeptoren) für die Funktion entwicklungsbiologisch bedeutender Faktoren notwendig sind. Wir beabsichtigen unser etabliertes PMM2 Stammzellmodell (PMM2-iPSCs) zu verwenden, um glykoproteomisch die Auswirkungen der PMM2-Mutationen auf alle drei Glykosylierungswege zu analysieren. Neben der vergleichenden Analyse von Stammzellen werden dabei Analysen, die die Differenzierung der Zellen zu Neuronen und Hepatozyten begleiten, durchgeführt, da beide Gewebe in Bezug zu den bei Patienten beobachteten Phänotypen stehen. Nach Klonierung der ersten C-Mannosyltransferase aus Caenorhabditis elegans (DPY-19) konnten wir zeigen, dass in Säugetieren vier homologe Enzyme (DPY19L1 bis DPYL4) existieren. DPY19L1 zeigt dabei evolutionär die höchste Konservierung. Um die funktionelle Bedeutung von DPY19L1 während der frühen humanen Embryonalentwicklung zu untersuchen, beabsichtigen wir ein Stammzellmodell zu generieren, in dem DPY19L1 funktionell inaktiv ist. Da initiale Experimente nahelegen, dass ein knock-out von DPY19L1 in humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) lethal ist, planen wir mittels CRISPR-Cas Zelllinien zu erzeugen, die einen induzierbaren knock-down oder knock-out erlauben. Ausgehend von diesen Zellen (DPY19L1-hPSCs) ist die Herstellung von Neuronen und Hepatozyten möglich. Ziel ist es die Zellmodelle zu nutzen, um in der Literatur beschriebene Störungen (z.B. neuronale Migration bei Mäusen nach knock-down von Dpy19L1) nachzustellen und molekulare Ursachen zu erforschen. Schließlich sollen beide Stammzellmodelle (PMM2-iPSCs sowie DPY19L1-hPSCs) verwendet werden, um den Einfluss von Mutationen in den entsprechenden Genen auf das Transkriptom zu untersuchen. Wir erwarten, dass Veränderungen in der Expression von Zielgenen durch eine fehlerhafte Glykosylierung von Zytokinen und/oder Membranrezeptoren verursacht werden, die dann durch bioinformatische Analyse quantitativer Genexpressionsdaten identifiziert werden können.
DFG-Verfahren
Forschungsgruppen
