Investigation of poly(A)-mediated RNA degradation in the model plant Arabidopsis thaliana
Final Report Abstract
In eukaryotischen Zellen werden viele verschiedene Sorten RNA synthetisiert, darunter auch eine Vielzahl sog. nicht-codierender oder nicht-mRNAs. Das sind RNAs, die im Gegensatz zu mRNAs nicht den Bauplan eines Protein verschlüsseln, sondern z.B. katalytische, regulatorische oder strukturelle Funktionen haben. Dazu kommen RNA Moleküle, die als Abfallprodukte beim Zuschneiden von primären Transkripten entstehen, und nicht-funktionelle Transkripte z. B. von DNA Abschnitten zwischen den eigentlichen Genen. Die meisten dieser RNAs bleiben im Zellkern und werden auch dort wieder abgebaut. In einem vorhergehenden Forschungsprojekt hatten wir entdeckt, dass manche dieser nicht-mRNAs mit kurzen Ketten aus Adenin-Nukleotiden markiert werden. Solche kurzen Poly(A)-Ketten dienen oft als eine Art Landebahn für abbauende Enzyme, die 3'-5' Exoribonucleasen. Ein solcher poly(A)-induzierter Abbaumechanismus war kürzlich in Hefe entschlüsselt worden. Ich wollte nun untersuchen, ob ein vergleichbarer Mechanismus auch im Zellkern von Pflanzen existiert, und die daran beteiligten Protein identifizieren. Zunächst haben wir mit Hilfe Datenbank-gestützter Sequenzvergleiche nach pflanzlichen Homologen von RRP6 gesucht. RRP6 ist eine Exoribonuclease im Zellkern von Hefe, die dort u.a. auch am Abbau polyadenylierter nicht-mRNAs beteiligt ist. Wir haben jeweils drei Gene für RRP6-ähnliche Proteine in den drei bisher vollständig sequenzierten Pflanzenarten Ackerschmalwand (Arabidopsis), Reis und Pappel gefunden. Eine phylogenetische Untersuchung hat gezeigt, dass jeweils zwei dieser Homologe, RRP6L1 und RRP6L2, eng mit den equivalenten Proteinen in Hefe, Mensch und Tier verwandt sind. Die RRP6L3 Proteine bilden dagegen eine eigene Gruppe, die sich nur in Pflanzen entwickelt hat. Pflanzen und andere höheren Eukaryoten haben oft mehrere Proteine eines Typs. Diese Homologe können gleiche (redundante) Funktionen haben oder auf eine bestimmte Funktion in der Zelle spezialisiert sein. Um das herauszufinden, habe ich a) die intrazelluläre Verteilung der verschiedenen RRP6L Proteine untersucht, und b) Arabidopsis Mutanten isoliert, in denen das Gen für RRP6L1, RRP6L2 oder RRP6L3 zerstört ist. Um die Verteilung der Proteine in Pflanzenzellen zu untersuchen, haben wir fluoreszierende Versionen der RRP6L Proteine in Arabidopsis Pflanzen exprimiert, und die Wurzelzellen dieser Pflanzen dann mit dem Fluoreszenz-Mikroskop untersucht. So haben wir entdeckt, dass sich jedes der drei RRP6L Proteine in einem anderen Teil der Pflanzenzelle aufhält: RRP6L1 befindet sich vorwiegend im Nucleoplasma, also in dem Teil des Zellkern, der die genomische DNA enthält und in dem die meisten mRNAs synthetisiert werden. RRP6L2 befand sich dagegen im Nucleolus, einem markanten Teil des Zellkerns, in dem insbesondere ribosomale RNAs synthetisiert, zugeschnitten, und in Ribosomenuntereinheiten eingebaut werden. RRP6L3 befand sich überraschenderweise nicht im Zellkern, sondern im Zytoplasma der Wurzelzellen. Die bisher durchgeführten Untersuchungen der Mutanten hat ergeben, dass RRP6L2 am Abbau eines bestimmten RNA-Stückes beteiligt ist, das in großen Mengen bei der Herstellung von ribosomaler RNA entsteht. Dieses Stück RNA wird in rrp612 Mutanten nicht mehr effizient abgebaut und statt dessen in polyadenylierter Form angereichert. Aus diesem Ergebnis lässt sich schlussfolgem, dass RRP6L2, nicht aber RRP6L1 und RRP6L3, für den Abbau nicht-funktioneller RNA im Nucleolus von Pflanzen gebraucht wird. Mittlerweile habe ich zwei weitere Proteine identifiziert die spezifisch mit RRP6L2 zusammenarbeiten. Wenn RRP6L2 und eines dieser Partnerproteine gleichzeitig ausgeschaltet werden, können sich sie Pflanzen nicht mehr normal entwickeln und sterben kurz nach der Keimung ab. Das zeigt, wie wichtig RNA Abbau im Nucleolus ist. Die Funktionen von RRP6L1 im Nucleoplasma bzw. von RRP6L3 im Zytoplasma konnte ich bisher noch nicht aufklären. Wir können aber schon jetzt sagen, dass die drei RRP6L Proteine keine überlappenden Funktionen haben, sondern jedes eine spezielle Aufgabe erfüllt. Offenbar sind die 3'-5' RNA Abbauwege in Pflanzen wesentlich komplexer organisiert als in anderen bisher untersuchten Organismen.
Publications
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(2008): Coping with cryptic and defective transcripts in plant mitochondria. Biochim. Biophys. Act., Gene Regulatory Mechanisms, Special Issue on RNA Quality Control, 1779:566-73
Holec S, Lange H, Canaday J and Gagliardi D
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(2008): Degradation of a polyadenylated rRNA maturation by-product involves one of the three RRP6-like proteins in Arabidopsis thaliana. Mol. Cell. Biol., 28, 3038-44
Lange H, Holec S, Cognat V, Pieuchot L, Le Ret M, Canaday J and Gagliardi D
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(2008): Polyadenylation-mediated RNA degradation in plant mitochondria. Methods in Enzymology 447 : 439-61
Holec S, Lange H, Dietrich A and Gagliardi D
