"Low-Volume" (LV)-Amplifikation und -Sequenzierung von DNA aus einzelnen Mitochondrien
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Um einzelne Mitochondrien separieren und analysieren zu können, müssten wichtige Parameter berücksichtigt und optimiert werden werden. Neben der Wahl einer geeigneten Mitochondrienisolationstechnik nimmt die Verwendung von Puffern unterschiedlicher Osmolarität Einfluss auf die Integrität der isolierten Partikel. Da Zellen verschiedener Gewebe bezüglich der Anzahl und Größe ihrer enthaltenden Mitochondrien erheblich variieren können, spielt die Wahl des biologischen Ausgangsmaterials für die Mitochondrienisolation eine besondere Rolle. Durch einen Vergleich verschiedener Isolationstechniken, Resuspensionsmedien und biologischer Ausgangsmaterialien konnte eine Methode gefunden werden, die für die Isolation von Mitochondrien aus Lebergewebe am besten geeignet war. Die Mitochondrienisolate waren dabei frei von unaufgebrochenen Zellen, die in Folgeanalysen stören würden. Freie DNA, die bei der Separation der mitochondrialen Partikel zu Kontaminationen führen kann, war in den Isolaten enthalten. Das zugehörige Kontaminationsrisiko konnte allerdings durch Verdünnungsmaßnahmen und den Einsatz von Separationsmethoden minimiert werden. Interessanterweise konnte ein Effekt des verwendeten mitochondrialen Farbstoffes auf die Beschaffenheit der Mitochondrien gefunden werden. Mitochondrien, die mit JC-1 oder Mitotracker Red 580 gefärbt wurden, zeigten im Gegensatz zu der Färbung mit Mitotracker green FM Tendenzen, miteinander zu verklumpen und Mitochondrienaggregate zu bilden. Bei einem Vergleich von drei verschiedenen Separationsmethoden, der FCM, LCM und der OT wurden einzelne mitochondriale Partikel abgelegt die aus Lebergewebe von Mus musculus oder Sus scrofa isoliert wurden. Diese Partikel konnten erfolgreich mittels einer Sequenzanalyse und qPCR analysiert werden. Mittels einer Kombination aus den qPCR-Daten und einem mathematischen Modell, welches auf der Sequenzanalyse basiert, konnte erstmals ein analytischer Nachweis dafür erbracht werden, dass insbesondere die OT geeignet sind, einzelne mitochondriale Partikel abzulegen. Humane Lymphozytenmitochondrien einer Probandin, die Trägerin einer Heteroplasmie ist, konnten erfolgreich mit Hilfe der OT separiert, abgelegt und schließlich analysiert werden. Bisher konnte ein heteroplasmatisches mitochondriales Partikel aufgefunden werden, was darauf schließen lässt dass Mitochondrien, die unterschiedliche Haplotypen aufweisen, miteinander fusionieren und somit selbst einzelne Mitochondrien Träger von Heteroplasmien sein können.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2010). Einflussfaktoren auf den Isolationserfolg von Mitochondrien und Analyse von einzelnen mitochondrialen Partikeln. Dissertation
Pflugradt R.
- A novel and effective separation method for single mitochondria analysis. Mitochondrion. 2011; 11(2):308-314
Pflugradt R, Schmidt U, Landenberger B, Sänger T, Lutz-Bonengel S
