Optimization of production of antimicrobial substances from terrestrial cyanobacteria - from screnning to bioreactor development
Final Report Abstract
Cyanobakterien haben mittlerweile einen festen Platz in biotechnischen Wertschöpfungsketten eingenommen. Hierbei handelt es sich jedoch vornehmlich um Cyanobakterien aus aquatischen Habitaten, während jene Luftexponiert vorkommenden Vertreter noch weitgehend außerhalb des Fokus für die Produktion von Wertstoffen liegen. Aufgrund ihres natürlichen Standorts wurde zunächst vermutet, dass ein optimales Wachstum die Gegenwart einer Oberfläche erfordert. In früheren Projekten wurden daher emerse Photobioreaktoren entwickelt, welche die Umgebung des natürlichen Habitats nachzuahmen vermögen. Mit diesem Bioreaktortyp konnte erfolgreich die EPS-Bildung, die als Ressource antimikrobieller Metabolite vermutet wurde, deutlich im Rahmen von Austrocknungsphasen während des Kultivierungsprozesses gesteigert werden. An dieser Stelle setzte nun das Kooperationsvorhaben der TU Kaiserslautern und der TH Bingen an: Terrestrische Cyanobakterien, die in einem vorangegangenen Screening als Produzenten antimikrobieller Komponenten identifiziert wurden, sollten eingehender charakterisiert und die Produktion unter Anwendung verschiedener Ernährungsweisen und Prozessführungen optimiert werden. Üblicherweise werden Cyanobakterien phototroph kultiviert, wofür der bestehende Reaktor weiter zu verbessern war. Erstmalig sollte aber auch versucht werden, diese Organismengruppe mit konkretem Bezug zu einem Wertstoff heterotroph und mixotroph zu kultivieren, wofür auch ein Rotating-Disc-Reaktor etabliert werden sollte, der eine gezielte Einstellung von Trockenphasen ermöglicht. Mit der Umstellung der Ernährungsweise von phototroph zu mixo- bzw. heterotroph zeigte sich, dass die zuvor lediglich phototroph kultivierten Stämme nicht als Reinkultur vorliegen. Daher wurde zunächst versucht, die Kulturen über verschiedene (mehrstufige) Axenisierungsprotokolle in eine Reinkultur zu überführen. Zwar konnte hiermit eine deutliche Reduktion der Begleitkeime erzielt werden, eine vollständige Entfernung der Begleitorganismen war hingegen nicht möglich. Als Hauptkeim konnte für den Modellstamm Nostoc spec. nach Isolierung und polyphasischer Taxonomie Bacillus spec. identifiziert werden, der für die antimikrobielle Wirkung des Stammes teilweise mitverantwortlich ist. Eine entsprechende Kontaminante wurde auch nach Anwendung des Axenisierungsprotokolls für den untersuchten Desmonostoc-Stamm detektiert. Daraufhin wurde entschieden, die Versuche zum mixotrophen und heterotrophen Wachstum hinsichtlich der bakteriellen (unvermeidbaren) Begleitkeime mittels qPCR zu überwachen. Hierfür wurde ein gesondertes Protokoll entwickelt. Des Weiteren wurde der Einfluss der Ernährungsweise auch auf die Produktion anderer interessanter Wertstoffe wie Pigmente und EPS untersucht. Diese Entscheidung erfolgte auch vor dem Hintergrund, dass beim parallel durchgeführten Screening nach potenziellen Wirkstoffproduzenten sowohl die natürlichen Isolate als auch die als axenisch deklarierten und von Stammsammlungen bezogenen terrestrischen Cyanobakterienstämme allesamt nicht axenisch vorlagen bzw. nicht mit den verfügbaren Protokollen axenisiert werden konnten. Von den untersuchten C-Quellen zeigten sich Raffinose und Glucose als sehr gut geeignet, um die beiden Modellstämme zu kultivieren. Anhand der etablierten qPCR-Analytik konnte verifiziert werden, dass die Cyanobakterien die dominierende Spezies der Mischkultur waren. Stressfaktoren, wie z.B. Nährstoffmangel, erwiesen sich dabei als Stimulus für die Produktion antimikrobieller Metabolite. Es stellte sich heraus, dass sich bei hohen Konzentrationen der C-Quelle (50 g/L) kaum Unterschiede im Wachstum bei mixotropher und heterotropher Kultivierung zeigten. Das parallel fortgesetzte Screening lieferte weitere Hits nicht-axenischer Kulturen. Erstaunlicherweise besaß der überwiegende Anteil der terrestrischen Cyanobakterien keine Fähigkeit zur Biofilmbildung. Da auch die Biofilmbildner nur ein schlechtes Wachstum im etablierten ePBR in einer Aerosolatmosphäre aufwiesen, wurde ein Moving-Bed-Reaktor entwickelt und verfahrenstechnisch charakterisiert, in dem diverse Stämme erfolgreich angezogen werden konnten. Darüber hinaus konnte mit dem heterotroph und mixotroph genutzten Rotating-Disk-Reaktor erfolgreich gezeigt werden, dass der Trocknungsstress einen deutlichen Einfluss auf die Zusammensetzung der Biofilmmatrix hat und dieser auch als Stimulus hinsichtlich der antimikrobiellen Aktivität fungierte. Methoden zur Aufarbeitung wurden entwickelt, allerdings konnte bis zum Projektabschluss keine Reinsubstanz gewonnen werden. Die etablierten Verfahren stehen aber nun für weitere Vorhaben zur Verfügung.
Publications
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