Flow cytometric analyses on the damage pattern of phenalen-1-one-mediated antimicrobial photodynamic therapy towards biofilms in vitro
Final Report Abstract
Angesichts der zunehmenden Zahl bakterieller Resistenzen gegenüber konventionellen antimikrobiellen Substanzen wie Antibiotika und Antiseptika ist es erforderlich, neue antimikrobielle Verfahren zu etablieren. Eine vielversprechende Alternative hierbei stellt die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) dar. Frühere Forschungsergebnisse unserer Arbeitsgruppe konnten zeigen, dass eine neue Klasse von Photosensibilisatoren (PS), die auf einer Phenalen-1-on (PN)-Struktur basieren, mit dem Lead-Kandidaten SAPYR eine ausgeprägte antimikrobielle Effektivität gegenüber planktonischen Kulturen und Biofilmen zeigen. Ziel dieses Projekts war es, den Wirkmechanismus und die Zielstrukturen der aPDT mit PN-Derivaten zu untersuchen. Dazu wurden zunächst Monospezies-Biofilme der Gram-positiven Bakterienspezies Actinomyces naeslundii und Streptococcus mutans sowie dem Gram-negativen Modellorganismus Escherichia coli kultiviert und anschließend mit aPDT und SAPYR in verschiedenen Konzentrationen und unterschiedlichen Inkubationsdauern behandelt und anschließend belichtet. Als Positivkontrollen für eine Schädigung der bakteriellen Membran wurden das Antiseptikum Chlorhexidindigluconat und das PN-Derivat SA-PN-05 verwendet. Die Replikationsfähigkeit der Bakterien nach aPDT wurde mittels koloniebildender Einheiten (KBE) evaluiert. Die Integrität der Zytoplasmamembran wurde mittels Durchflusszytometrie nach Färbung mit SYBR Green und Propidiumjodid untersucht und mittels Rasterund Transmissionselektronenmikroskopie visualisiert. Weiterhin wurden mittels Lumineszenz- und Fluoreszenzmessungen die Stoffwechselaktivität sowie die Bildung intrazellulärer ROS untersucht. Zudem wurden die molekulare Stressreaktion auf Protein- und Transkriptomebene mittels Western Blot und RNA-Sequenzierung bei planktonischen E. coli-Kulturen nach aPDT mit SAPYR und Behandlung mit CHX untersucht. Außerdem erfolgte eine Untersuchung der Toxizität der aPDT auf humane primäre Parodontalligament (PDL)-Zellen mittels KVT- und XTT-Assay. Es konnte gezeigt werden, dass bei verringerter Replikationsfähigkeit nach aPDT mit SAPYR die Membranintegrität bei E. coli, nicht aber bei S. mutans und A. naeslundii reduziert war. Lumineszenzund Fluoreszenzmessungen zeigten nach aPDT mit SAPYR eine verringerte Stoffwechselaktivität und die Bildung intrazellulärer ROS. Daraus ergab sich die Hypothese, dass es durch die vermehrte Bildung intrazellulärer ROS nach aPDT mit SAPYR zu einer reduzierten Replikationsfähigkeit kommt, die die Ergebnisse auf KBE-Ebene erklären könnte. Die Proteinexpressionsanalysen mit planktonischen E. coli- Kulturen ergaben eine erhöhte Expression des Proteins RecA, welches bei einer Schädigung der DNA aktiviert wird. Die Ergebnisse der RNA-Sequenzierung mit E. coli zeigten, dass es sowohl nach aPDT mit SAPYR als auch nach der Behandlung mit CHX zu einer veränderten Expression von Genen kam, die mit Prozessen an der bakteriellen Membran zusammenhängen. Außerdem kam es zu einem erhöhten Abbau von Fettsäuren, was die Bildung von intrazellulären ROS bestärken kann. Die Untersuchung der Toxizität der aPDT mit SAPYR auf humane PDL-Zellen zeigte eine konzentrations- und behandlungsdauerabhängige signifikante Reduktion der Zellviabilität. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit verdeutlichen, dass die Aufklärung der Wirkmechanismen antimikrobieller Substanzen essenziell ist, um potenzielle Risiken einer Adaptation oder Resistenzentwicklung abschätzen zu können.
Publications
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