Modellgestützte Steuerung der Kristallisierbarkeit von Proteinen in biotechnologischen Prozessen

• Antragsteller: Professor Dr. Jürgen Hubbuch; Professor Dr.-Ing. Dirk Weuster-Botz
• Fachliche Zuordnung: Bioverfahrenstechnik
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 315315694

Bis heute lassen sich geeignete Bedingungen für die technische Proteinkristallisation nur empirisch auffinden. Ziel des Vorhabens ist die bisher übliche aufwändige empirische durch eine modellgestützte Herangehensweise zu ersetzen. Im Verlauf der ersten Förderperiode konnte bereits beispielhaft mithilfe von Neutronenstrahl- und Röntgenstrahl-Diffraktometrie sowie MD-Simulationen anhand gezielt erzeugter Mutanten der Lactobacillus brevis Alkoholdehydrogenase (LbADH) gezeigt werden, dass rationales Protein-Engineering zu einer mechanistisch erklärbaren Verbesserung der Proteinkristallisation führt. In diesem Folgevorhaben soll zunächst eine Übertragung der gewonnenen Erkenntnisse auf ein verwandtes Enzym, die Lactobacillus kefir Alkoholdehydrogenase (LkADH) erfolgen. Es soll kristallographisch und molekulardynamisch untersucht werden, ob Mutationen, die die Kristallisation der LbADH verbessern konnten, in ähnlicher Weise die intermolekularen Kräfte bei der LkADH Kristallisation verstärken. Die experimentellen Ergebnisse zur Kristallisation der LkADH und ausgewählter Mutanten sollen für die Validierung und Erweiterung der theoretischen Erkenntnisse genutzt werden. Darauf aufbauend sollen diese Erkenntnisse zur Proteinkristallisation und deren Beeinflussung erstmalig für die de novo Kristallisation von zwei bisher nicht kristallisierbaren Proteinen nutzbar gemacht werden, einer Dihydroxysäuredehydratase und einer Enreduktase. Mithilfe von Homologiemodellen sollen zunächst Aminosäurepositionen bestimmt werden, die potentielle Kristallkontakte ausbilden können. Durch rationales Protein-Engineering soll nachfolgend eine Verstärkung der Wechselwirkungen an den Kristallkontakten herbeigeführt werden. Für die Vorhersage des Kristallisationsverhaltens sollen die überarbeiteten molekulardynamischen Methoden genutzt und nach experimenteller Evaluierung die molekularen Erkenntnisse zur Proteinkristallisation erweitert werden. Die experimentelle Evaluierung erfolgt sowohl durch die Charakterisierung des Phasenverhaltens der Proteine mithilfe von Hochdurchsatz-Screening Methoden als auch durch deren rheologische Charakterisierung in Lösung mithilfe der Hochfrequenzrheometrie, um ein umfassendes Verständnis über den Zusammenhang des viskoelastischen Verhaltens gelöster Proteine und deren Kristallisationsneigung zu erlangen. Abschließend soll eine Prozess analysierende Technologie (PAT) Methode zur selektiven Quantifizierung von Konzentrationsänderungen des Zielproteins mittels UV/Vis Spektroskopie erarbeitet werden, um eine Echtzeitüberwachung der Kristallisation möglich machen zu können. Das gemeinsame Forschungsvorhaben von TUM und KIT umfasst von der molekularen Betrachtung (Protein-Engineering und MD-Simulation) über die mikroskopische Skala (Phasenverhalten und Rheologie) auch die makroskopische Skala (PAT), um so eine ganzheitliche ingenieurwissenschaftliche Aufklärung grundlegender Prinzipien der technischen Proteinkristallisation zu ermöglichen.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1934: Dispersitäts-, Struktur- und Phasenänderungen von Proteinen und biologischen Agglomeraten in biotechnologischen Prozessen
• Mitverantwortlich: Privatdozent Dr.-Ing. Dariusch Hekmat