Die Rolle der Rezyklisierung in der O-Glykosylierung des transmembranären Glykoproteins MUCI
Final Report Abstract
Das apikale transmembranäre Glykoprotein MUC1 rezyklisiert vielfach durch das Trans-Golgi-Netzwerk oder den Golgi zurück zur Plasmamembran. Wir verfolgten im Rahmen dieser Studie die Hypothese, dass nicht nur die bereits bekannte Reifung der Glykoformen des MUC1 in Richtung auf vermehrte Sialinierung der O-Glykane mit diesem Prozess assoziiert ist, sondern auch eine Remodellierung/Prozessierung der O-Glykan-Core-Strukturen. Die Hypothese basierte auf früheren Erkenntnissen, die besagten, dass sezernierte Glykoformen des Mucins mit nur einer Golgi-Passage sich durch überwiegende Expression von Core 2-basierenden O-Glykanen auszeichnen, während membranständige, rezyklisierende Glykoformen von Core 1-Strukturen dominiert werden. Um den Zusammenhang von Rezyklisierung und O-Glykosylierung aufzuzeigen, haben wir rekombinante epitop-markierte Wildtyp-Sonden des MUC1 und davon abgeleitete mutierte Isoformen mit eingeschränkter Clathrin-vermittelter Endocytose (MUC1-M-Y20+60/N) und solche mit vollständig blockierter Rezyklisierung ((palmitoylation-defective MUC1-M-CQC/AQA) generiert und in drei Zellmodellen exprimiert. Wir konnten zeigen, dass die CQC/AQA-Mutante in Endosomen akkumuliert und stark eingeschränkt von der Zelloberfläche in den Extrazellularraum abgeschilfert wird. In Übereinstimmung mit unserer Hypothese waren diese in das Kulturmedium abgegebenen Glykoformen der mutierten, nicht-rezyklisierenden Membransonde, ähnlich wie bei sezernierten Isoformen, durch ein Vorherrschen Core 2-basierender Glykane ausgezeichnet. Die Sonde mit eingeschränkter Clathrin-vermittelter Endocytose zeigte dagegen kaum Änderungen des O- Glykosylierungsprofils gegenüber der Wildtyp-Sonde (dominante Core 1 Expression). Die daraus abgeleitete Vermutung, dass die MUC1-Rezyklisierung über alternative Endocytosewege erfolgen könnte (caveolärer Transport, Caveolin-unabhängige, Flotillin-abhängige Transportwege) konnte durch Colokalisations- und Inhibitionsexperimente in der confokalen Lasermikroskopie bestätigt werden. Darüberhinaus konnten wir Hinweise auf einen „frühen“ Wiedereintritt über das Endoplasmatische Reticulum in den Sekretionsweg erbringen. Auch für die N-Glykosylierung des Asn36 der kleinen MUC1-Transmembran-Untereinheit konnten Zusammenhänge zwischen zellulärem Trafficking und der Rezyklisierungs-abhängigen Prozessierung im Golgi aufgezeigt werden, insofern als unreife „High-Mannose“-Glykoformen des MUC1 selektiv über Exosome exportiert zu werden scheinen.
Publications
- (2009). Proteomics of MUC1 containing lipid rafts from plasma membranes and exosomes of human breast carcinoma cells MCF-7. Proteomics 9, 2820-2835
Staubach S, Razawi H, Hanisch FG
- (2011). Lipid rafts: signaling and sorting platforms of cells and their role in cancer. Expert Rev. Proteomics 8, 263-277
Staubach S, Hanisch FG
- (2012). MUC1 membrane trafficking: protocols for assessing biosynthetic delivery, endocytosis, recycling, and release through exosomes. Methods Mol. Biol. 842, 123-140
Hanisch FG, Kinlough CL, Staubach S., Hughey RP
