Wolfram-abhängige Aldehyd-Oxidoreduktasen: spezifische W-Cofaktor Insertion und dessen Interaktionen mit Fe-S-Zentren in Katalyse und Reifung

• Antragsteller: Professor Dr. Johann Heider
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 311062180

Aldehyd:Ferredoxin-Oxidoreduktasen (AOR) gehören zu einer Familie von Wolfram-haltigen Enzymen, die meist von hyperthermophilen Archaeen bekannt sind. Sie enthalten einen Wolfram-bis-Molybdopterin Cofaktor als Teil des aktiven Zentrums und unterscheiden sich genetisch und strukturell von den anderen drei Enzymfamilien Molybdopterin-abhängiger Enzyme, die meist Molybdän statt Wolfram enthalten. Wir habe kürzlich in dem mesophilen denitrifizierenden Bakterium Aromatoleum aromaticum eine ungewöhnlich Sauerstoff-stabile AOR entdeckt, die viele aromatische und aliphatische Aldehyde zu den entsprechenden Säuren oxidiert. Das gereinigte Protein besteht aus einer alpha-Untereinheit, die den W-Cofaktor sowie ein Fe4S4-Zentrum enthält, einer kleinen beta-Untereinheit mit weiteren vier Fe4S4-Zentren sowie einer mittleren gamma-Untereinheit mit einem FAD Cofaktor. Diese komplexe Zusammensetzung und die Beständigkeit gegen Sauerstoff unterscheidet diese AOR deutlich von den archaeellen Orthologen und rechtfertigt eine detailliertere Untersuchung des Enzyms. Wir wollen die katalytischen und strukturellen Eigenschaften dieses neuen Typs an AOR charakterisieren, besonders in Bezug auf die Funktion der offenbar vorhandenen Kette von Fe-S-Zentren, die bei AOR aus Archaeen fehlt. Besonderes Augenmerk wird dabei auf ihre eventuelle Beteiligung an der reversen Reaktion oder der Sauerstoff-Toleranz des Enzyms gelegt. Zusätzlich wird die AOR in rekombinanter Form zugänglich gemacht werden, was auch die Generierung und Charakterisierung von mutierten Varianten ermöglicht, mit denen weitere Aussagen zur Funktion der einzelnen Fe-S-Zentren erhalten werden können. Ein zweites Haupt-Thema ist der Mechanismus der W-Cofaktor Biosynthese und des korrekten Einbaus in AOR. A. aromaticum synthetisiert zugleich funktionelle Enzyme mit Mo- und W-Cofaktoren und braucht deshalb eine spezifische Maschinerie für deren Synthese und Einbau. Um mehr Information darüber zu bekommen, werden wir die Enzyme des Biosynthesewegs charakterisieren, die in mehrfachen Kopien im Genom codiert sind, besonders die Mo/W-einbauenden Proteine MoeA und die MoaD-Proteine, die für den Einbau der Thiol-Gruppen der Molybdopterine verantwortlich sind. Wir werden die gereinigten Proteine studieren und versuchen, zusammen mit weiteren gemeinsam genutzten Komponenten ein in-vitro-System der W-Cofaktor Biosynthese und der Aktivierung von Apoenzym-Vorläufern der AOR zu entwicklen. Zusätzlich wird die Notwendigkeit der jeweiligen Faktoren auch durch die Erzeugung von Deletionsmutanten überprüft. Wir werden besonders auch einem hypothetischen neuen Weg der Cofaktor-Reifung für Enzyme der AOR-Familie nachgehen, der eine direkte Beteiligung von AOR und der Fe-S-Zentren vorsieht.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1927: Iron-Sulfur for Life