Funktionelle Untersuchungen zum Mechanismus des Eisen-Schwefel-Cluster-haltigen Proteins HypD bei der Biosynthese der CO- und CN-Liganden von [NiFe]-Hydrogenasen

• Antragsteller: Professor Dr. Gary Sawers
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 310984010

[NiFe]-Hydrogenasen sind Eisen-Schwefel (FeS)-Enzyme, die einen NiFe(CN)2CO-Cofaktor im aktiven Zentrum ihrer großen Untereinheit aufweisen. Der Cofaktor wird von sechs konservierten Hyp-Proteinen synthetisiert. Die Synthese der Fe(CN)2CO-Gruppe des Cofaktors wird an einem HypCDEF-Proteingerüst bewerkstelligt und dann in eine Vorläuferform der großen Untereinheit eingefügt. HypD bildet den Kern des Gerüstkomplexes und koordiniert zusammen mit HypC die Fe(CN)2CO-Gruppe über zwei konservierte Cysteinylthiole; eines von HypD (C41) und eines von HypC (C2). Die Cyanidliganden werden gemeinsam von der Carbamoyltransferase HypF und der Dehydratase HypE erzeugt. Unbekannt ist, ob der CO-Ligand vor oder nach den Cyanid-Liganden auf das Fe transferiert wird. Unsere Arbeitshypothese besagt, dass das Substrat für den CO-Liganden jenes CO2 ist, welches an HypC nachgewiesen wurde. HypD hat einen [4Fe-4S]-Cluster, und in der letzten Antragsperiode haben wir das Redoxpotential des Clusters mit Eo ’ = -262 mV bestimmt. Wir haben auch gezeigt, dass zwei konservierte Cys-Reste (C69 und C72) in zwei aufeinanderfolgenden Einelektronen- und Protonentransferschritten einen Disulfid-Thiol-Austausch durchführen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass HypD eine ATPase-Aktivität hat (ADP wird gebildet), die von Cys41 abhängt. Bei dem Versuch, den Elektronendonor für das FeS-Cluster von HypD zu identifizieren, konnten wir Ferredoxin für diese Funktion ausschließen. Wir analysieren derzeit, ob eines der beiden in E. coli vorkommenden Flavodoxine in dieser Funktion fungiert. Anhand von Protein-Protein-Interaktionsstudien und nativer Massenspektrometrie konnten wir zeigen, dass nur HypC oder dessen Paralog HybG mit dem Vorläufer der großen Untereinheit interagiert, HypD jedoch nicht. Somit bildet HypC entweder mit HypD oder mit dem entsprechenden Vorläufer der großen Untereinheit einen Komplex und katalysiert eine Thioltransferase-Reaktion sowohl bei der Synthese der Fe(CN)2CO-Gruppe als auch bei deren endgültigen Transfer in das Zielprotein. In der nächsten Förderungsperiode werden wir die ATPase-Aktivität von HypD detaillierter charakterisieren. Wir werden bestimmen, welche Aminosäuren und Motive für die ATPase-Aktivität von HypD erforderlich sind. Wir werden auch bestimmen, ob die Wechselwirkung von HypD mit HypC die ATP-Hydrolyse beeinflusst. Die Tatsache, dass ATP durch HypD hydrolysiert wird, stimmt mit unserer Arbeitshypothese überein, dass das Enzym CO2 (Eo '= ca.-530 mV) oder möglicherweise eine Carboxylatgruppe reduziert. Mit dem von uns entwickelten ATPase-Test werden wir versuchen, diese Aktivität nachzuweisen. Weitere Experimente konzentrieren sich auf die Reihenfolge der Bindung der diatomaren Liganden, den Transfer der Fe-(CN)2CO-Gruppe durch HypC auf die große Untereinheit und die Identifizierung weiterer Interaktionspartner von HypD und HypC, um Erkenntnisse über die in vivo-Donatoren des Fe2+-Ions und des Vorläufermetaboliten für den CO-Liganden zu gewinnen

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1927: Iron-Sulfur for Life