Funktionelle Bedeutung der intrazellulären Lokalisation von Proteinkinase D
Final Report Abstract
Der Protein Kinase D (PKD) Enzymfamilie, einer Gruppe von Diacylglycerol (DAG) und Phorbolester bindenden Serin/Threonin Kinasen, gehören drei Isoformen an: PKD1/ PKCp, PKD2 und PKD3/ PKCv. Die subzelluläre Lokalisation der PKD-Isoformen variiert abhängig von Zelltyp und Aktivierungsstimulus und hat entscheidenden Einfluß auf den Aktivierungsmodus und die verfügbaren Substrate. Es ist deshalb nicht überraschend, dass für PKD sehr unterschiedliche Funktionen wie z.B. Schutz vor Apoptose und Regulation des sekretorischen Transports beschrieben wurden. In Epithelzellen lokalisieren PKD1, PKD2 und PKD3 im Zytosol und am Golgi-Apparat. Als Rezeptor für PKD am Golgi-Kompartiment dient das Lipid Diacylglycerol, das an die cysteinreiche Domäne von PKD bindet. Am Golgi- Apparat erfolgt die Aktivierung von PKD durch nPKC-abhängige Phosphorylierung, als Substrat wurde die Lipidkinase Pl4Klllß identifiziert. Eine Phosphorylierung durch PKD aktiviert PI4Klllß, erhöht die lokale Konzentration von Pl(4)P und ist für die Abschnürung von sekretorischen Transportvesikeln vom Golgi-Apparat essentiell. Das Ceramid Transfer Protein CERT, ein weiteres Golgi-assoziiertes PKD-Substrat, konnte im Rahmen dieses Projektes identifiziert werden. Die PKD-vermittelte Phosphorylierung kontrolliert die Bindung von CERT an Golgi Membranen und damit die Lipidtransferaktivität. CERT selbst ist für die PKD-Aktivierung am Golgi-Komplex und für sekretorischen Transport essentiell. Damit konnte ein klarer Zusammenhang zwischen Lipid Metabolismus, Membranintegrität und sekretorischen Transport aufgezeigt werden. Die essentielle Rolle von PKD für die Integrität des Golgi-Komplexes konnte desweiteren durch die Verwendung eines neuen, genetisch kodierten Reporters bestätigt werden. In einem zweiten Aspekt haben wir uns mit der Funktion von PKD in der Zellmigration beschäftigt. Hier konnten wir zeigen, daß PKD die Chemotaxis von Krebszellen negativ reguliert. Aktive PKD lokalisiert am sog. „leading edge" migrierender Zellen und interagiert dort direkt mit F-Aktin. Als potentielles PKD Substrat in diesem Zusammenhang wurde Cortactin, ein Aktin-bindendes Protein, identifiziert. Cortactin ist aktiv an der Polymerisation und Vernetzung von Aktin beteiligt und damit für Zellmigration essentiell. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass PKD Zellmigration u.a. durch Remodellierung des Aktin Zytoskeletts kontrolliert. Schließlich haben wir transgene Mausmodelle etabliert, mit denen eine gewebsspezifische und induzierbare Ausschaltung der PKD Funktion möglich wird und in ersten Studien an neuronalen Geweben solcher Mäuse „proof of concept" des transgenen Modells erhalten. Mit diesen Mauslinien eröffnen sich nun zahlreiche Möglichkeiten, gewebsspezifische und globale PKD-Funktionen in vivo zu analysieren.
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