Structural and functional analysis of mating type locus encoded transcription factors from the Penicillia
Microbial Ecology and Applied Microbiology
Final Report Abstract
Kreuzungstyp (engl. Mating type MAT) -kodierte Transkriptionsfaktoren (TF) von Pilzen weisen strukturelle Ähnlichkeiten zu pflanzlichen und tierischen TF auf und regulieren unterschiedlichste Entwicklungsprozesse. wie z.B. Paarungsprozesse im Verlaufe der sexuellen Vermehrung oder auch Stoffwechselprozesse bei denen Sekundärmetaboliten gebildet werden. In diesem DFG geförderten Projekt wurde die Struktur und Expression von Kreuzungstypgenen verschiedener Penicillium-Arten, die eine biotechnologische Relevanz besitzen, untersucht. "Penicillium brevicompactum", ein pilzlicher Produzent des Immunsuppressivum Mycophenolsäure, besitzt einen heterothallischen Lebenszyklus, und trägt entweder den Kreuzungtyp- Locus MAT1-1 oder MAT1-2. Beide Loci kodieren für Transkriptionsfaktoren (TF), die eine konservierte Primärstruktur aufweist, welche Homologien zu Kreuzungstyp TF anderer Aspergillus- und Penicillium-Arten aufweisen. Knock-out Stämmen mit fehlenden Kreuzungstyp Loci waren für Funktionsanalysen eine entscheidende Voraussetzung und haben den molekularen Nachweis erbracht, dass die Kreuzungstyp-Gene sowohl transkriptionell als auch translational exprimiert werden. Die Charakterisierung der Knock-out Stämme im Vergleich zu den Wildtypstämmen hat zudem gezeigt, dass der Kreuzungstyp Locus bei diesem Pilz die Konidiosporenbildung und die Zellmorphologie beeinflusst, und somit entscheidend die Entwicklung dieses biotechnologisch bedeutenden Pilzes kontrolliert. Um Aussagen zur Struktur-Funktion von Kreuzungstyp-kodierten TF zu erhalten, wurden die entsprechenden TFs des Penicillin-Produzenten "Penicillium chrysogenum" und des Humanpathogens "Aspergillus fumigatus" für Kristallisationsexperimente in E. coli synthetisiert. Die darauf erfolgten Versuche zur Kristallisation der Proteine zusammen mit Oligonukleotiden, welche die Erkennungssequenz für den TF tragen, waren erfolgreich und führten zu wesentlichen Ansätzen für die optimale Röntgenstrukturanalyse. Unter anderem konnten Selenomethionin substituierte TFs hergestellt werden, die eine maximale Auflösung von 3.2 Aangström lieferten. Damit konnte zum ersten Mal die dreidimensionale Struktur einer Alpha-Domäne eines Kreuzungstyp-kodierten TF aufgeklärt werden, der eine entscheidende Rolle bei der sexuellen Vermehrung spielt.
Publications
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