Unravelling mechanisms by which Zinc influences diversity and multi-resistance of porcine intestinal Escherichia coli populations
Final Report Abstract
Seit 2006 sind antimikrobielle Fütterungszusatzstoffe in der Europäischen Union (EU) verboten. Gerade für Absatzferkel wurden daher Alternativen für die Prävention und Therapie von Durchfallerkrankungen eingesetzt, um die meist durch enterotoxische E. coli (ETEC) hervorgerufen Verluste in der Schweinehaltung zu reduzieren. Weltweit wird das Spurenelement und Schwermetall Zink in Form von Zinkoxid (ZnO) zu diesem Zweck verfüttert. Aus der Literatur ist bekannt, dass Schwermetallresistenzgene mit antimikrobiellen Resistenzgenen (ARGs) auf mobilen genetischen Elementen co-lokalisiert sind. Vorarbeiten zu diesem Projekt im Rahmen des SFB852 haben gezeigt, dass die Fütterung von ZnO anscheinend einen wesentlichen Effekt auf die Diversität der intestinale E. coli-Population hat, da diese bei den zinkgefütterten Ferkeln (i) eine höhere genetische Variabilität und (ii) eine höhere Rate von multiresistenten Isolaten aufwies. Die Aufklärung der phylogenetischen Variabilität mittels Ganzgenomsequenzierung sowie der mechanistischen Ursachen zur Wirkung von Zink auf intestinale E. coli Populationen waren daher die Ziele dieses Projektes. Hierfür wurden insgesamt 179 repräsentative E. coli- Isolate aus einer Zinkfütterungsstudie mit Absatzferkeln ausgewählt, wobei 99 Isolate aus der Zinkfütterungsgruppe (high-zinc fed group [HZG]) und 80 Isolate aus der Kontrollgruppe [CG] stammten. Für alle Isolate wurde initial mittels Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) die Empfindlichkeit gegenüber Zinkchlorid (ZnCl2), weiterer Schwermetalle und verschiedenen Antibiotika im Mikrodilutionsverfahren bestimmt. Die ermittelten ZnCl2 MHKs für porcine intestinalen E. coli entsprachen dabei insgesamt einer Normalverteilung, wie sie in einer Wildpopulation zu erwarten gewesen wäre. Durch ein lineares gemischtes Regressionsmodell wurde eine statistisch signifikante Assoziation zwischen den „höheren“ ZnCl2 MHK-Werten und Isolaten der HZG sowie den „niedrigen“ ZnCl2 MHK-Werten und Isolaten der CG gezeigt (p = 0,005). Die Zinktoleranzwerte in dieser Studie konnten jedoch in keinen statistischen Zusammenhang mit dem Auftreten eines bestimmten Antibiotikaresistenz-Phäno- und/oder Genotyps gebracht werden. Die weiterführende Analyse der Ganzgenomdaten (WGS) zeigte, dass Faktoren, welche an der Aufrechterhaltung der Zinkhomöostase in E. coli beteiligt sind (z.B. Export-assoziiert Gene wie zitB, zntA, pit) in allen Genomen vorhanden waren und die Sequenzanalysen auch keinen Hinweis auf funktionale Defizite ergaben. So stellen nach unseren Ergebnissen entgegen der einschlägigen Literatur diese Genloci keine Marker für Zinkresistenz dar. Die Bayesian Analysis of Population Structure (BAPS) der Genome der HZG- und CG-Isolate zeigte ferner keine Assoziation zwischen Zinktoleranz und einem bestimmten phylogenetischem Cluster oder Abschnitt der E. coli-Population. Die Nachweisraten für Gene und Operons, die mit Virulenz (VAGs) und Bakteriozinen (BAGs) assoziiert sind, waren für HZG Isolate insgesamt niedriger (41% gegenüber 65% und 22% gegenüber 35%, p < 0,001 p = 0,002). Besonders interessant war, dass E. coli mit VAG-Kombinationen der typischen Pathotypen für Darmerkrankungen, also enterotoxigene, enteropathogene und Shiga-Toxin produzierende E. coli (ETEC, EPEC und STEC), nur 1% der Isolate der HZG ausmachten, aber 14% der Isolate aus der CG. Eine Regressionsanalyse ergab, dass die Fütterungsgruppe (p <0,001) sowie die jeweilige ZnCl2-MHK (p <0,001) mit der Anzahl der in einem Isolat vorhandenen VAGs assoziiert war. Zum Beispiel hatten Isolate, die zum CG gehörten, eine 4,4- mal höhere Wahrscheinlichkeit, eine höhere Anzahl an VAGs zu beherbergen (95% -Konfidenzintervall: 2,0 - 9,8) als E. coli aus dem HZG. Auch die in diese Studie eingeschlossenen klinischen Isolate vom Schwein zeigten in keinem Fall eine Zinktoleranz über dem MHK von 256 μg/ml. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit früheren Studien, die von der modulierenden Wirkung von Zink auf die intestinale Mikrobiota sowie sinkenden PWD-Raten bei Absatzferkeln berichteten.
Publications
- Tracking the effects of high-Zinc oxide diets in porcine intestinal E. coli populations. National Symposium on Zoonoses Research 2017, Berlin, 12.10.-13.10.2017
V.C. Johanns, T. Semmler, B. Walther, L.H. Wieler
- Modulatory effects of high zinc oxide diets on porcine intestinal Escherichia coli populations. Junior Scientist Zoonoses Meeting, Hamburg, 07.06.-09.06.2018
V.C. Johanns, T. Semmler, B. Walther, L.H. Wieler
- Different levels of zinc tolerance among porcine Escherichia coli. Junior Scientist Zoonoses Meeting, Berlin, 20.06.-22.06.2019
V.C. Johanns, F. Ghazisaeedi, L. Epping, T. Semmler, B. Walther, L.H. Wieler
- Effects of a Four-Week High-Dosage Zinc Oxide Supplemented Diet on Commensal Escherichia coli of Weaned Pigs. Frontiers in Microbiology, 2019. Nov 28; 10(2734)
V.C. Johanns, F. Ghazisaeedi, L. Epping, T. Semmler, A. Lübke-Becker, Y. Pfeiffer, A. Bethe, I. Eichhorn, R. Merle, B. Walther, L.H. Wieler
(See online at https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.02734) - Four-week high zinc oxide diets: effects on commensal intestinal Escherichia coli- populations of weaned piglets. National Symposium on Zoonoses Research 2019, Berlin, 16.10.-18.10.2019
V.C. Johanns, F. Ghazisaeedi, L. Epping, T. Semmler, B. Walther, L.H. Wieler
- henotypic zinc resistance does not correlate with antimicrobial multi-resistance in fecal E. coli isolates of piglets. Gut pathogens, 2020. 12(4)
F. Ghazisaeedi, L. Ciesinski, C. Bednorz, V. Johanns, L. Pieper, K. Tedin, L.H. Wieler, S. Günther
(See online at https://doi.org/10.1186/s13099-019-0342-5) - High-zinc supplementation of weaned piglets affects frequencies of virulence and bacteriocin associated genes among intestinal Escherichia coli populations. Frontiers in Veterinary Science, 2020. Nov 20;High-zinc supplementation of weaned piglets affects frequencies of virulence and bacteriocin associated genes among intestinal Escherichia coli populations. Frontiers in Veterinary Science, 2020. Nov 20
V.C. Johanns, L. Epping, T. Semmler, F. Ghazisaeedi, A. Lübke-Becker, Y. Pfeifer, I. Eichhorn, R. Merle, A. Bethe, B. Walther, L.H. Wieler
(See online at https://dx.doi.org/10.3389%2Ffvets.2020.614513)
