Regulierung der mRNA-Prozessierung in Trypanosoma brucei: Kinetik, Faktoren und Mechanismen

• Antragstellerin: Professorin Dr. Christine Elizabeth Clayton
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Parasitologie und Biologie der Erreger tropischer Infektionskrankheiten
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 290543715

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass sich verschiedene Vorgänge während der Prozessierung eukaryotischer mRNA gegenseitig beeinflussen. Ein Beispiel ist die Polyadenylierung, welche einen mechanistischen Zusammenhang zwischen Spleißen und Transkription aufweist. Zudem beeinflussen diese Vorgänge im Zellkern das spätere Schicksal der mRNA im Zytoplasma. Mit diesem Projekt wollen wir solche Phänomene in Trypanosoma brucei untersuchen. T. brucei ist ein geeignetes Modell zur Erforschung post-transkriptioneller Regulierung, da das Spleißen unabhängig von der RNA-Polymerase ist und die Transkription von Genen nicht individuell gesteuert wird. Die mRNA-Mengen werden daher ausschließlich durch die Prozessierungsrate und die Abbau-Kinetik bestimmt. Dies ermöglichte die Entwicklung eines mathematischen Models zur teilweisen Vorhersage von mRNA-Mengen unter Einbeziehung gemessener Halbwertszeiten. Die Ergebnisse zeigten , dass Unterschiede in der Prozessierungseffizienz auch eine wichtige Rolle spielen.Wir, eine deutsche und eine israelische Antragstellerin, haben während der letzten 30 Jahre mit Trypanosomen gearbeitet. Die Deutsche Antragstellerin ist Expertin auf dem Gebiet des mRNA-Abbaus, während die Israelische Antragstellerin auf dem Gebiet der Prozessierung führend ist. Gemeinsam wollen wir den Einfluss der Sequenzen von mRNA-Vorläufern auf die Effizienz der mRNA-Prozessierung erforschen, und den Einfluss der Spleiß- und Polyadenylierungskinetik auf die Menge der betroffenen mRNA messen. Außerdem können RNA-bindende Proteine diese Vorgänge regulieren. Die dahinterstehenden Mechanismen wollen wir genauer untersuchen. Zunächst werden in Deutschland klassische Reporter-Assays entwickelt, um den Einfluss von Prozessierung auf die mRNA-Menge endgültig zu klären. Danach werden Reporter-Plasmide adaptiert, um den Effekt von Protein-Bindung durch "Tethering" zu untersuchen. Diese Plasmide dienen der Genom-weiten Identifizierung von Faktoren, die die mRNA-Prozessierung beeinflussen können (Tethering Screen). Die israelische Gruppe wird währenddessen drei ausgewählte und teilweise charakterisierte Faktoren (HNRNPF/H, TSR1 und TSR1IP) weiter untersuchen. Mittels Hochdurchsatz-RNA Sequenzierung werden die genauen Effekte von RNAi gegen dieser drei Faktoren auf mRNA-Prozessierung und mRNA-Mengen gemessen. Außerdem werden durch iCLIP die RNA Sequenzen, an die die drei Faktoren binden, identifiziert. Zudem werden Interaktionspartner der drei Faktoren durch Komplex-Reinigung und die Hefe-2-Hybrid Methode bestimmt. Potentielle Interaktionspartner, die auch durch das Tethering identifiziert wurden, werden anschließend auf ihre genauen Wirkungsmechanismen und ihre Rolle auf die drei Faktoren untersucht. Die Ergebnisse sollten es uns erlauben, die Kontrolle der mRNA-Prozessierung und deren Einfluss auf die Mengen der mRNA besser zu verstehen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Israel
• ausländ. Mitantragstellerin: Professorin Dr. Shulamit Michaeli