HDAC-abhängige Regulation und funktionelle Charakterisierung der Rolle von WT1 bei replikativem Stress

• Antragsteller: Professor Dr. Oliver Holger Krämer
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 286787523

Ziel dieses Projekts ist die Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die den Transkriptionsfaktor WT1 regulieren. Zudem soll ein besseres Verständnis der Funktionen von WT1 in primären und permanenten leukämischen Zellen unter replikativem Stress und bei DNA Schäden gewonnen werden. Unsere Untersuchungen konzentrieren sich auf die Kontrolle von WT1 durch epigenetische Modulatoren aus der Klasse I Histondeacetylase (HDAC) Familie. Diese induzieren den proteasomalen Abbau des WT1 (über eine Induktion der E2 Ubiquitin-Konjugase UBCH8) und einen Verlust der WT1 mRNA. Wir wollen definieren, welche Klasse I HDACs die Expression der Gene für WT1 und UBE2L6 (kodiert UBCH8) kontrollieren. Weiter möchten wir klären, welche Zielproteine von WT1 die Apoptose bei einer unterbrochenen DNA Replikation modulieren. Zusätzlich wollen wir erkennen, ob WT1 direkt auf Signalkaskaden, die unter replikativem Stress induziert werden, den DNA Replikationskontrollpunkt und das Ausmaß von DNA Schäden Einfluss nimmt. Hierbei möchten wir auch die Funktionen der Checkpoint Kinasen ATM, ATR, and CHK1/CHK2 besser verstehen. Außerdem wollen wir die HDAC-abhängige Regulation und die biologische Wertigkeit des pro-apoptotischen Faktors NOXA für das Überleben von leukämischen Zellen bei replikativem Stress und einem damit einhergehenden Verlust von WT1 definieren. Unser Ansatz ist biochemisch und molekularbiologisch orientiert. Wir erzeugen Bedingungen unter denen der zelluläre dNTP Pool durch Hydroxyurea reduziert wird, wir verwenden den für die Klasse I HDACs HDAC1, -2 und -3 spezifischen Inhibitor MS-275, und wir schalten für uns interessante Proteine genetisch aus. Die von uns eingesetzten Methoden sind Western Blot zur Detektion von Protein Expression und Phosphorylierung, quantitative real-time PCR, konfokale Mikroskopie, quantitative Proteom-Analysen, i-POND, DNA Faser-Assay, Durchflusszytometrie zur Bestimmung der Zellvitalität, CRSPR-Cas9 und RNAi.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen