Funktionelle und strukturelle Charakterisierung des UbiX Flavoproteins von Escherichia coli
Final Report Abstract
Im Rahmen dieses Projektes war das Eschehchia cofi Flavoprotein UbiX funktionell und strukturell zu charakterisieren. UbiX war wie UbiD als 3-Oktaprenyl-4-hydroxybenzoat Decarboxylase annotiert worden und soll daher eine entscheidende Rolle in der Ubiquinon-Biosynthese spielen. In Vorarbeiten hatte ich His-UbiX als rosanes Protein gereinigt. Massenspektrometrische Analysen zeigten, daß UbiX neben FMN auch rosane und grün-blaue Addukte von FMN mit niedermolekularen Verbindungen, die in den meisten Fällen fünf C-Atome hatten, bindet. Eine funktionelle Rolle von UbiX im Isopentenyldiphosphat-Stoffwechel (und damit dem Isoprenoid-Stoffwechsel und möglicherweise indirekt in der Ubiquinon-Biosynthese) war angesprochen worden. Im Rahmen des Forschungsstipendiums wurden weitergehende Arbeiten zur Charakterisierung der Flavinaddukte (z. B. nach Hitzedenaturierung von His-UbiX) durchgeführt, leider ließ sich daraus die enzymatische Funktion von UbiX nicht ableiten. Cysteinreste von His-UbiX in den Positionen 87 und 121 wurden gegen Alaninreste ausgetauscht, die Charakterisierung der Flavinaddukte der mutierten UbiX-Protein führte aber auch nicht zu Erkenntnissen über die Funktion von UbiX. Das ubiX-Gen aus Methanocaldococcus jannaschii wurde in E. coli kloniert und exprimiert. Im Gegensatz zum Eschehchia coli Protein bindet dieses Flavoprotein ausschließlich FMN und keine Flavinaddukte. Eine Interaktion von UbiX mit den Enzymen UbiA (4-Hydroxybenzoat-Octaprenyltransferase) und UbiD der Ubiquinon-Biosynthese konnte nicht nachgewiesen werden, ebensowenig eine Interaktion von UbiX mit den Enzymen IspG (1-Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphat-Synthase) und IspH (4-Hydroxy-3-methyl- 2-(H)-butenyl-4-diphosphat-Reuktase) der Isopentenyldiphosphatsynthese. Es konnte aber die Interaktion von UbiX mit FldA (Flavodoxin l) nachgewiesen werden und eine Halbreaktion von UbiX gezeigt werden: UbiX-FMN oxidiert FldA-FMNH2 zu FldA-FMN und wird dabei selbst zu UbiX-FMNH2 reduziert. Da vor kurzem gezeigt wurde, daß fldA ein essentielles Gen für den MEP-lsoprenoid Biosyntheseweg ist und wahrscheinlich essentiell für die von IspG katalysierte Reaktion ist, haben wir nun einen weiteren Hinweis, daß UbiX (zumindestens indirekt) an der Isopentenyldiphosphatbiosynthese beteiligt ist. Andererseits wird eine Reihe unterschiedlichster Proteine durch Flavodoxin reduziert und in den letzten Jahren sind auch Veröffentlichungen erschienen, die eine Funktion von UbiX bei der Decarboxylierung von 3-Octaprenyl-4-Hydroxybenzoat zu bestätigen scheinen. In weiteren Experimenten wurde das zu UbiX homologe BsdB-Protein aus Bacillus subtilis charakterisiert. Hierbei handelt es sich möglicherweise um ein Membranprotein, die Maltosebindeprotein-BsdB Fusion ist jedoch wie UbiX ein lösliches, rosanes Protein. Die BsdBCD-Proteine aus Bacillus subtilis sind als Vanillatdecarboxylase beschrieben worden und im Rahmen des Forschungsstipendiums und des DFG-Normalverfahrens konnte zum erstenmal diese Decarboxylierungsreaktion in vitro mit gereinigten Proteinen gezeigt werden. Es sieht jedoch so aus, als ob nur die Proteine BsdC und BsdD den Decarboxylasekomplex bilden, während BsdB (bzw. UbiX) nicht direkt mit dem Substrat interagiert sondern möglicherweise den BsdCD-Komplex regeneriert. Fazit: Das Flavoprotein UbiX wurde weiter charakterisiert, BsdB wurde erstmals als Flavoprotein beschrieben, die Interaktion der Flavoproteine FldA und UbiX und die Reduktion von UbiX durch FldA wurde gezeigt. Ferner konnte die Decarboxylierung von Vanillinsäure durch den gereinigten BsdCD-Komplex nachgewiesen werden. Die zweite Halbreaktion von UbiX und damit die Funktion in der Ubiquinonbiosynthese oder der Isopentenyldiphosphatbiosynthese bleibt weiterhin offen.
