Role of Nuclear Interactions of Paramyxoviral Matrix Proteins: Cellular ANP32B in Host Manipulation and Virus Replication
Final Report Abstract
Das Projekt befasste sich mit der Rolle nukleärer Interaktionen von paramyxoviralen Matrixproteinen und konzentrierte sich auf das zuvor als Interaktionspartner von henipaviralen M Proteinen identifizierte ANP32B (Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member B). Hauptziele des Vorhabens war es zu untersuchen, inwieweit ANP32B ein Wirtsfaktor ist, der über das Genus Henipavirus hinaus mit anderen viralen Matrixproteinen interagiert und möglicherweise Teil eines zentralen und konservierten Interaktionsmechanismus darstellt. Darüber hinaus sollten auf viraler Seite interagierende Sequenzmotive kartierte werden, um ggf. später Bindungsnegative Virusmutanten für nachfolgende in vitro Infektions- und in vivo Pathogenesestudien zu generieren. Aufgrund der bekannten zellulären Funktionen von ANP32B in der zellulären Genregulation sowie Apoptose- und Immunregulation sind sowohl direkte Effekte auf die Virusreplikation als auch Pathogenese-relevante immunologische Funktionen denkbar. Während wir zur Beginn des Projektes aufgrund von Nipahvirus Infektionen in shRNA knock down Zellen nicht davon ausgingen, dass ANP32B eine direkte Rolle in der Virusreplikation fehlt und die Bedeutung der Interaktion eher in vivo auf immunologischer Ebene gesucht werden muss, konnten im Verlauf des Projektes mit Hilfe von CRISPR-Cas knock out Zellen allerdings erste Hinweise erzielt werden, dass ANP32B einen gewissen negativen Einfluss auf die Virusvermehrung hat. Aktuelle Publikationen über immunregulatorische Funktionen lassen allerdings vermuten, dass eine Bindung von ANP32B durch viralen Matrixproteine eine möglicherweise wesentlich relevantere Funktion in der viralen Pathogenese hat. In vergleichenden Interaktionsstudien konnten wir zeigen, dass die Interaktion von ANP32B mit viralen Matrixproteinen innerhalb der Familie der Paramxoviridae konserviert ist, während keine Hinweise für eine derartige Interaktion mit Pneumovirus order Rhabdovirus M Proteinen erzielt werden konnten. Darüber hinaus wurde mit den Arbeiten gezeigt, dass die ANP32B abhängige nukleäre Hendra Virus (HeV) M Akkumulierung vom nukleären Kernimport des ANP32B abhängt. Weiterhin zeigte die spezifische Kopräzipitation von M-ANP32B (keine Reinigung von M-ANP32A Komplexen), dass die Interaktion hoch spezifische ist und das alleinige Vorliegen eines stark negativ geladenen C-terminale Region oder einer Leucinreichen N-terminalen Region, die beide in allen ANP32 Proteinen vorliegen, nicht für die Interaktion ausreicht. Konkret ist der hier erfolgte Nachweis einer intrazellulären Interaktion von ANP32B mit M aus Newcastle disease virus (NDV, Genus Avulavirus) und Sendai virus (SeV, Genus Respirovirus) von besonderer Bedeutung, da damit erstmals im Vergleich zu Henipaviren Paramyxoviren geringere Sicherheitsstufe zur Verfügung, die in nachfolgenden Projekten für systematische Pathogenesestudien verwendet werden können. Insbesondere im Hinblick auf mittlerweile entwickelte Maus-ANP32B Maus-knock out Linien bietet SeV als natürliches Mauspathogen hier ein enormes Potential um die postulierte Rolle von ANP32B in der viralen Pathogenese zu untersuchen. Umfangreiche Ala-Scan Mutagenesen über das gesamt HeV M Protein und deren Analyse führte zu einem umfassenden Überblick über die Bedeutung einzelner Aminosäurebereiche für die ANP32B abhängige Kernakkumulierung des M Proteins. Trotz Identifizierung von 10 intrazellulär nicht mehr interagierenden Mutanten zeigt die Gesamtheit der Daten, dass eher die positive Nettoladung der Proteinoberfläche für hoch spezifische Interaktion mit ANP32B verantwortlich ist statt einzelner Aminosäurepositionen. Während dies vermutlich die Generierung von rekombinanten, nicht bindenden Virusmutanten unmöglich macht, sind die hier gewonnenen Erkenntnisse insbesondere im Hinblick auf das breite Vorkommen dieser Virus-Wirt Interaktion und deren potentieller Bedeutung ein wichtiger Beitrag für die weitere wissenschaftliche Bearbeitung von Virus-Wirt Interaktionen in der Virusreplikation und Pathogenese.
Publications
- Expression, characterisation and antigenicity of a truncated Hendra virus attachment protein expressed in the protozoan host Leishmania tarentolae. J Virol Methods. 2016 Feb; 228:48-54
Fischer K., dos Reis VP., Finke S., Sauerhering L., Stroh E., Karger A., Maisner A., Groschup M.H., Diederich S., Balkema-Buschmann A.
(See online at https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2015.11.006)
