Beeinflussung der Lipidzusammensetzung membranöser viraler Replikationsorganelle durch das Hepatitis C Virus

• Antragsteller: Professor Dr. Volker Lohmann
• Fachliche Zuordnung: Virologie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 278191845

Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein Plusstrang RNA Virus aus der Familie Flaviviridae. Die Lipidkinase Phosphatidylinositol 4-phosphate Kinase IIIa (PI4KIIIa/PI4KA) ist ein essentieller Wirtszellfaktor der HCV Replikation in Zellkultur und konvertiert Phosphatidylinositol zu Phosphatidylinositol 4-Phosphat (PI4P). Die enzymatische Aktivität von PI4KA wird von HCV aktiviert, was zu stark erhöhten intrazellulären PI4P Konzentrationen führt. Wir haben festgestellt, dass die Aktivierung von PI4KA in Huh7-Hepatom Zellen für die meisten HCV-Isolate schädlich ist, was die ineffiziente Replikation von Patientenisolaten in Zellkultur erklärt. Wir konnten zeigen, dass replikationsverstärkende Mutationen auf dem Verlust der Aktivierung von PI4KA beruhen, um hohe PI4KA-Expression in Hepatomzellen im Vergleich zu primären Hepatozyten zu kompensieren, die zu einer Überproduktion von PI4P führt. Basierend auf PI4KA/Casein-Kinase Iα (CKIα) Inhibitoren können wir jetzt HCV wt Isolate effizient in Zellkultur vermehren. Dadurch konnten wir das neue HCV Genotyp 1b wt Isolat GLT1 identifizieren, das in Zellkultur sehr effizient repliziert. Die Replikation von HCV GLT1 kann durch PI4KA/CKIα-Behandlung oder durch Expression von Sec14L2, einem Lipidtransportprotein, das in Hepatozyten exprimiert wird, aber nicht in Huh7, um bis zu 4 Größenordnungen stimuliert werden. Sec14L2 wurde vor kurzem ebenfalls als Möglichkeit zur Steigerung der Replikation von HCV wt Isolaten identifiziert, der Mechanismus ist aber kaum definiert und der Effekt ist für alle bisher getesteten Isolate moderat. Die dramatische Steigerung der GLT1 Replikation durch Sec14L2 oder PI4KA/CKIα-Inhibition bietet nun die einzigartige Möglichkeit, die Determinanten der HCV Replikation in Zellkultur auf molekularer Ebene zu verstehen, sowie den Einfluss von Sec14L2 auf die Lipid- und Proteinzusammensetzung und die Morphologie von HCV-Replikationsorganellen. Dazu verfolgt dieser Verlängerungsantrag drei Ziele: 1. Verständnis der Mechanismen, die der GLT1-Replikation zugrunde liegen, indem Chimären mit einem verwandten gt1b-Isolat erzeugt werden. Wir werden auch versuchen, das GLT1-Isolat für eine effiziente Virusproduktion zu adaptieren, um das erste Infektionsmodell für gt1b in Zellkultur zu erhalten. 2. Wir werden lipidomische und proteomische Analysen von gereinigten Replikationsorganellen mit und ohne Sec14L2 unter Verwendung eines Replikase-Expressionsmodells analysieren und die entsprechenden Lipid- und Protein-Kandidaten experimentell validieren. 3. Ein ultrastruktureller Vergleich von viralen Membranveränderungen in Anwesenheit und Abwesenheit von Sec14L2 wird die Struktur authentischer HCV Replikationsorganelle identifizieren. Wir werden außerdem die Verteilung von Kandidatenlipiden relativ zu viralen Replikationsvesikeln mittels Live-Cell-Imaging und Super-Resolution-Mikroskopie klären.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen