Entwicklung einer in vitro Methodik zur qualitativen und quantitativen Evaluation der intrinsischen Thrombogenizität kardiovaskulärer Prothesen
Final Report Abstract
Die übergeordnete Zielsetzung des hier beschriebenen Projektes bestand in der Konzeption, Evaluation und Etablierung eines artifiziellen in vitro Kreislaufsystems mit Schafblut, auf dessen Grundlage die intrinsische Thrombogenizität kardiovaskulärer Implantate qualitativ und quantitativ beurteilt werden sollte. Nach Modifikation und Evaluation des auf einem bereits in der Arbeitsgruppe existierenden, jedoch wesentlich einfacher konzipierten Systems basierenden artifiziellen Kreislaufs (neu: laminäre und pulsatile Flussbedingungen, Mindestflussrate 400 ml/min, Mindestdruck 100 mmHg und online Messung von Blutgas- und Druckwerten, etc.), wurden zunächst hämatologische und hämostaseologische Labormethoden auf ihre Eignung zur Analyse des Blutes hin evaluiert und Referenzwerte für ovine Blutwerte ermittelt. Anschließend wurde die Haltbarkeit und hämostaseologische Funktionsfähigkeit des Schafblutes in CPDA-1 enthaltenden Blutbeuteln sowie im artifiziellen Kreislaufsystem untersucht. Bezüglich der Lagerungsstabilität des CPDA-1-stabilsierten Blutes erwies sich dies bei Lagerung im Beutel für mindestens einen Arbeitstag und im artifiziellen Kreislauf für mindestens zwei Stunden stabil. Bei den Untersuchungen im artifiziellen System erwies es sich als Hürde, eine sichere Diskrimination zwischen Kreisläufen mit eingebautem Glasröhrchen (Positivkontrolle) und dem „nativen“ Silikonschlauchsystem als neutrale Ausgangsprobe zu erreichen. Als Gründe hierfür wurden definiert: (1) die limitierte Verfügbarkeit spezifischer Aktivierungsmarker der plasmatischen Gerinnung für Schafblut und (2) eine durch das Testgefäß nur geringe Aktivierung des Blutes wegen des initial relativ großen Verteilungsvolumen im Kreislauf sowie der Antikoagulation des Blutes. Erst nach daraufhin initiierter umfangreicher Modifikation der Versuchsanordnung, wie z.B. der Verkleinerung des Schlauchsystems, des Ersatzes der Pumpenköpfe gegen kleinere und der Rekalzifizierung des Blutes, sowie der ergänzenden Berücksichtigung weiterer Messgrößen (Plättchenaktivierungsmessgrößen, strukturelle Analysen der Prothesen) konnten schließlich die geplanten in vitro Testungen kardiovaskulärer Prothesen erfolgen. Mittels einer als optimal ermittelten Kreislaufzeit von 8 Minuten zwischen Rekalzifizierung und Stop der Reaktion ließ sich das mittlere Plättchenvolumen (MPV) als eine sehr präzise und zuverlässige Größe zur Unterscheidung der intrinsischen Thrombogenizität verschiedener Testgefäße definieren. Darüber hinaus wurden alle Prothesen mit Hilfe licht- und rasterelektronenmikroskopischer Methoden analysiert. Hier zeigte sich, dass bei einigen, gut lichtdurchlässigen Prothesen, Flächen auf denen thrombotisches Material abgelagert wurde, optisch gut von nicht betroffenen Arealen abgrenzbar waren (Helligkeitsunterschiede). Mit Hilfe Bild beund verarbeitender Programme, wie Photoshop und ImageJ ließen sich so die mit Thrombus belegten Flächenanteile berechnen und vergleichen. Wenngleich diese Methode nur auf lichtdurchlässige und plane Präparate (z.B. Silikon und PTFE) angewendet werden konnte und dickere, weniger lichtdurchlässige und unebene Präparate (z.B. dezellularisierte Gefäße oder Dacron-Prothesen) dieser Methode nicht gut zugänglich waren, ergaben sich zu den hämatologischen Befunden vergleichbare Unterschiede zwischen den Prothesen. Perspektivisch soll durch Analyse weiterer thrombozytärer Faktoren (diesbezügliche Analysen wurden bereits begonnen), sowie die Fortführung der Analysen auf Basis bildverarbeitender Methoden das bisher Erreichte ergänzt, in seiner Aussage unterstützt und auf die Evaluation weiterer kardiovaskulärer Prothesen ausgedehnt werden.
Publications
- Development of a Multipurpose Bioreactor System for in vitro Generation and Evaluation of Small Calibre Vessel Grafts – preliminary results. Leibniz Symposium Hannover 2007
Bonehie M, Alm S, Mischke R, Wilhelmi M
- (2010): Measurement of platelet aggregation in ovine blood using a new impedance aggregometer. Veterinary Clinical Pathology 39, 149-156
Baumgarten, A., Wilhelmi, M., Kalbantner, K., Ganter, M., Mischke, R.
