Verbundverfahren zur Detektion von Mikroorganismen imTrinkwasser
Final Report Abstract
Eine regelmäßige mikrobiologische Wasserüberwachung ist ein wichtiger Faktor im öffentlichen Gesundheitsschutz bezüglich der Risikoerkennung und des Risikomanagements. Insbesondere die Anwesenheit von pathogenen Mikroorganismen im Wasser sollte regelmäßig kontrolliert werden, um Ausbrüche von Krankheiten zu verhindern. Die alleinige Bestimmung der Fäkalindikatoren E. coli, coliforme Keime und Enterokokken im Trinkwasser reicht als alleiniges Kriterium nicht aus, wie es zum Beispiel der kürzliche Ausbruch von Legionellen in Ulm zeigte. Zur Überwachung der wasserassoziierten Krankheitserreger sollten möglichst auch die Bezugsquellen für das Trinkwasser (Rohwasser aus z.B. Oberflächenwasser, geklärtes Abwasser, Grundwasser) hinzugezogen werden, wenn man den Water-Safety-Plan der WHO umsetzen will. Dies bedeutet für die Zukunft ein enormer Untersuchungsaufwand, der nur durch einfachst bedienbare, automatisierte Multiplex- Schnellanalyseverfahren bewerkstelligt werden kann. Da dies die etablierten mikrobiologischen Standardverfahren nicht leisten können, muss die Grundlage für neue Schnellanalysenverfahren geschaffen werden. Genau hier setzte dieses Projekt an. Es wurden mechanische und (bio-)chemische Anreicherungsverfahren aufgebaut, die ohne manuelle Eingriffe ablaufen können und miteinander kombinierbar sind. Es wurden für die Immunomagnetische Separation von Enterobacteriaceae Antikörper-gekoppelte Magnet-Nanopartikel entwickelt, wobei ein generisch wirksamer Anti-ECA (Enterobactereaceae common antigen) Antikörper eingesetzt wurde, der nach IMS auf Sandwich- Immunoassays in Mikrotiterplatten und auf Antikörper-Mikroarrays lebende E. coli-Zellen mit einer Nachweisgrenze (NWG) von 2,6 x 105 Zellen/mL bestimmt, was unterhalb der zuvor veröffentlichten NWG nach Kultivierung war. Es wurde ein Cross-Flow-Mikrofiltration(CFM)-Prototyp zur automatisierten Anreicherung von Bakterien aufgebaut, der eine Wasserprobe mit einem Volumen von 10 L innerhalb von 15 Minuten auf ein Volumen von 50 mL einengt. Es konnte dabei gezeigt werden, dass im Leitungswasser E. coli-Zellen im Bereich von 1 – 104 cfu / 100 mL mit einer durchschnittlichen Wiederfindung von 91,3 ± 5,9% konzentriert werden können. Das CFM-Gerät wurde des Weiteren für die Anreicherung aus Fließgewässerproben verwendet. Hier zeigten sich anfangs sehr hohe Wiederfindungen von 104,7 ± 4,5%; nach Regeneration der Filtermodule sank die Wiederfindung auf bis zu 57,7 ± 16,1%. Diese Experimente zeigten, dass für Oberflächenwasser zukünftig Einweg-Module eingesetzt werden sollten, ansonsten aber reproduzierbare hohe Wiederfindungen mit einem CFM-Gerät erreicht werden können. Die Kombination von CFM mit einer neu entwickelten monolithischen Affinitätschromatographie (MAC) hat für Wasserproben mit einem geringen Anteil an partikulären Bestandteilen (Trinkwasser, Leitungswasser, Prozesswasser, Grundwasser) ein großes Potential, weil störende Matrixbestandteile abgetrennt werden können und eine Konzentrierung um den Faktor 250 innerhalb von 5 Minuten möglich ist. In weniger als 30 min kann somit eine Wasserprobe von z.B. 10 L auf 200 µL bei einer gleichzeitigen hohen Wiederfindung von Bakterien wie z.B. E. coli oder Legionella pneumophila eingeengt werden. Die Bakterien im Konzentrat konnten sowohl mit Kultivierungsverfahren, quantitativer PCR als auch Antikörper- Mikroarrays nachgewiesen werden. Der aufgebaute Durchfluss-Antikörper-Mikroarray zeigte eine niedrigere NWG als die bislang eingesetzten ELISA-Testformate. Dies liegt hauptsächlich an den geringen Diffusionskonstanten der Bakterien, so dass das Überströmen über einer Mikroarray- Chipoberfläche im Mikrokanal geringere Inkubationszeiten benötigt. Hitzeinaktivierte pathogene Bakterien konnten innerhalb von 15 Minuten nachgewiesen werden, wobei für E. coli O157:H7 mit 3000 Zellen/mL die geringste NWG erzielt werden konnte. Eine noch niedrigere NWG kann nur erreicht werden, wenn als Nachweis-Molekül für Bakterien die genomische DNA verwendet wurde, die mit einer Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert werden konnte. Hier ist eine NWG von 100 Zellen/mL erreichbar, so dass in Kombination mit CFM und MAC aus einer Wasserprobe von 10 L die geforderten Grenzwerte von 1 Zelle in 100 mL erreicht werden können. Die Probenvorbereitungsschritte (Zelllyse, DNA-Extraktion, PCR) sind jedoch nach aktuellem Stand der Technik noch sehr zeitaufwendig und minimal für die Anwendung in der Wasseranalytik automatisiert. Dennoch sind DNA-Mikroarrays generell als Alternative für Antikörper-Mikroarrays anzusehen, da DNA-Sonden gegen definierte Ziel-Sequenzen des Bakteriengenoms leichter verfügbar sind. Ein Mikroarray-Chip für die mikrobiologische Wasseranalytik, der alle relevanten pathogenen Mikroorganismen und seine Indikatororganismen simultan nachweisen kann, wird somit schneller entwickelt werden können, so lange keine neuen Antikörper für die wasserassoziierten Mikroorganismen verfügbar sind.
Publications
- Development of an epoxy-based monolith used for the affinity capturing of Escherichia coli bacteria. Journal of Chromatography A 2009, 1216, 3794-3801
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- Immunomagnetic nanoparticle-based sandwich chemiluminescence-ELISA for the enrichment and quantification of E. Coli. Microchimica Acta 2010, 168, 1-8
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- Stopped-flow microarray immunoassay for detection of viable E. coli by use of chemiluminescence flow-through microarrays. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2010
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(See online at https://doi.org/10.1007/s00216-010-4414-0)
