Durchflusszytometer
Final Report Abstract
Bestimmung der Signalaktivität vom B-Zellrezeptor (BCR) (Arbeitsgruppe Prof. Dr. H. Jumaa): Die Entstehung und Aktivierung der B-Lymphozyten sind streng regulierte Prozesse, die bei Fehlregulation zu unkontrollierter Zellteilung und maligner Transformation oder Autoimmunerkrankungen führen können. Unsere Projekte zielen darauf, die molekularen Mechanismen, die diese Prozesse regulieren, zu verstehen. Für die Mehrzahl unserer Projekte ist die Bestimmung der Signalaktivität in B Zellen von zentraler Bedeutung. Diese Bestimmung erfolgt über die Messung der Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration. Bei der Chronischen Lymphatischen Leukämie (CLL) vermehren sich z.B. krankhafte B-Lymphozyten in unkontrolliertem Ausmaß und verursachen eine der häufigsten Blutkrebserkrankung in der westlichen Welt. Die Ursache dieser unkontrollierten Zellteilung ist unklar, es wird allerdings angenommen, dass chronische BCR Signale dafür notwendig sind. Bisher wurde vermutet, dass unbekannte körpereigene Substanzen oder Krankheitserreger an den BCR binden und dadurch die unkontrollierte Zellteilung der CLL B-Lymphozyten aktivieren. Wir konnten zeigen, dass die BCRs auf CLL B-Lymphozyten ungewöhnliche Eigenschaften haben, durch die eine zellautonome, Antigen-unabhängige Aktivierung möglich wird. Interne Bereiche der Rezeptoren auf CLL B-Lymphozyten sind so geformt, dass sie wie Schlüssel und Schloss zueinanderpassen, wodurch sich benachbarte Rezeptoren derselben Zelle gegenseitig erkennen und die unkontrollierte Teilung der CLL B-Lymphozyten aktivieren. Die gegenseitige Rezeptorerkennung wurde in kristallographischen Untersuchungen ermittelt und in lebenden Zellen bestätigt. Bei den Untersuchungen an lebenden Zellen wird die autonome Signalaktivität der B-Zellrezeptoren über die Bestimmung der Kalziumkonzentration bestimmt. Unsere Arbeitsgruppe ist weltweit die einzige, die über ein geeignetes System für die Bestimmung autonomer Signale verfügt. Für dieses System sind Messungen am LSR erforderlich. In analogen Experimenten untersuchen wir die Rolle der konstanten Region des BCR. Wir konnten zeigen, dass die konstante Region sowohl die autonome als auch die Antigen-abhängige Signalaktivierung beeinflusst. Auch dafür sind Messungen am LSR erforderlich. Das Gerät wurde von der Arbeitsgruppe “Molekulare Immunologie” (AG-Leiter: Prof.Dr.Hans Jörg Fehling) des Instituts für Immunologie vor allem zur Bearbeitung von 2 Projekten intensiv genutzt: Projekt 1: Charakterisierung hämatopoetischer Stamm- und Progenitorpopulationen Mll5-defizienter Mausmutanten, sowie mehrerer Doppelmutanten (Mll5/Ifnar, Mll5/Ink4a, Mll5/Bid, Mll5/Tmem173). Mll5-defiziente Mäuse haben hämatopoetische Stamm- und Progenitordefekte und sind strahlenempfindlich. Unsere Arbeiten haben die molekularen Mechanismen, die diesen Defekten zu Grunde liegen, untersucht und einen bis dahin unbekannten Reaktionsweg aufgeklärt. So konnten wir zeigen, dass der Verlust von Mll5 zu DNA-Doppelstrangbrüchen und DNA-Reparaturdefekten führt, die eine Typ I Interferonausschüttung verursachen. Über den Typ I Interferon Signalweg werden dann intrazellulär toxische ROS-Konzentrationen induziert (ROS = Reaktive Sauerstoffspezies), die für die hämatopoetischen Stammzelldefekte ursächlich verantwortlich sind. Die Arbeit an diesem Projekt erforderte die zuverlässige Unterscheidung von mindestens 7 Fluoreszenzparametern und die Charakterisierung kleinster Stammzellpopulationen, die nur mit einem leistungsfähigen Durchflusszytometer, wie dem beschafften Gerät, möglich war. Projekt 2: Genetische Markierung lymphatischer Vorläuferstadien: In vivo „fate mapping“ mit pTa/iCre und Gata3/vYFP „knock-in“ Mäusen. GATA-3 ist ein Transkriptionsfaktor, der in der T-Lymphopoese eine essenzielle Rolle spielt. Um extra-thymische T-Zellvorläufer nicht-invasiv detektieren zu können, haben wir in den endogenen Gata3 Genlokus eine cDNA inseriert, die das fluoreszierende Protein Venus Yellow Fluorescent Protein (vYFP) kodiert. Mit Hilfe des beschafften Durchflusszytometers konnten wir kleinste, Gata3-exprimierende Zellpopulationen in Knochenmark, Thymus und sekundären lymphatischen Organen identifizieren und umfassend charakterisieren. Einzelne Datensätze wurden einem Kooperationspartner (Prof. Dr. Rudi W. Hendriks/Rotterdam) zur Verfügung gestellt. Vor allem dank der Qualität der Zytofluorometrie-Daten, die in diesen Vorarbeiten gewonnen wurden, konnten außerdem erfolgreich DFG-Drittmittel eingeworben werden. Ohne regelmäßigen Zugang zu einem Hochleistungs-Durchflusszytometer, wie dem beschafften Gerät, wären diese Erfolge nicht möglich gewesen.
Publications
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