Regulation of ART-mediated plasma membrane protein degradation in yeast
Final Report Abstract
Die Plasmamembran (PM) ist die äußerste zelluläre Hüllmembran und umschließt den gesamten intrazellulären Raum. Daraus ergibt sich, dass alle Interaktionen einer Zelle mit ihrer Umgebung über die PM erfolgen müssen. Zellen sind stetig schwankenden Bedingungen ausgesetzt und passen sich an diese an, indem sie die Protein-Zusammensetzung der PM verändern. Dies erfolgt durch Biosynthese von neuen Proteinen sowie den endozytotischen Abbau existierender Proteine. Bei vielen PM Proteinen werden Endozytose und folgender Abbau durch Ubiquitinierung eingeleitet. In der Bäckerhefe S. cerevisiae ist die E3 Ubiquitin-Ligase Rsp5 ein Hauptvermittler der PM Protein- Ubiquitinierung und der damit verbundenen Markierung für die endozytotische Aufnahme. Die Interaktion zwischen Rsp5 und seinen Substraten wird häufig indirekt von Arrestinverwandten Adaptern (ARTs) vermittelt. Vieles deutet darauf hin, dass die ARTs auch eine zentrale regulatorische Funktion bei der Rsp5-vermittelten Ubiquitinierung von Proteinen der PM übernehmen. Es ist jedoch bisher unverstanden, wie genau ARTs abzubauende PM Proteine erkennen und binden und wie dies wiederum reguliert wird. In diesem Projekt wurden die molekularen Eigenschaften eines Art1-Modellsubstrates, der Methionin-Permease Mup1, hinsichtlich ihrer Relevanz für den Art1-Rsp5-vermittelten endozytotischen Abbau untersucht. So wurde aufgedeckt, dass die cytosolische N-terminale Region von Mup1 für den Abbau in Abhängigkeit von Art1 und Rsp5 notwendig ist. Erstens konnte gezeigt werden, dass diese Region jene Lysine beherbergt, die von Rsp5 ubiquitiniert werden. Zweitens wurde innerhalb der cytosolischen N-terminalen Region von Mup1 eine saure Region identifiziert, die für die Art1-Rsp5-abhängige Ubiquitinierung von entscheidender Bedeutung ist. Genetische Evidenz, die im Rahmen dieser Studie erlangt wurde, legt nahe, dass diese saure Region direkt an der Interaktion zwischen Mup1 und Art1 beteiligt ist. Es zeigte sich zudem, dass sich die saure Region und die ubiquitinierten Lysine in räumlicher Nähe zueinander und zur Membran befinden müssen. Es kann daher angenommen werden, dass die Art1-Rsp5 Aktivität auch von einem zweiten Abbausignal abhängig ist und dass dieses nicht Bestandteil der N-terminalen cytosolischen Region ist. Insgesamt identifiziert und charakterisiert diese Studie ein dreigeteiltes Art1-Erkennungssignal in Mup1. Es wird vorgeschlagen, dass die Zugänglichkeit dieses Erkennungssignals die Rekrutierung von Art1 und Rsp5 regulieren könnte. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Anwesenheit einer sauren Region nahe einer potentiellen Ubiquitinierungsstelle und deren entscheidende Bedeutung für den endozytotischen Abbau auch bei einem weiteren Art1-Substrat vorliegt, der Arginin-Permease Can1. Dies lässt den Schluss zu, dass die Substraterkennung durch Art1 auch bei anderen Substraten einem ähnlichen Mechanismus folgt. Zuletzt wurde ein neuer Regulator des PM-Proteinabbaus mittels eines genomweiten Screens identifiziert. Zusammengefasst verbessert diese Arbeit unser Verständnis vom Mechanismus und der Regulation des Ubiquitin-abhängigen endozytotischen Proteinabbaus.
