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Massenspektrometer

Subject Area Biological Chemistry and Food Chemistry
Term Funded in 2014
Project identifier Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 265388167
 
Final Report Year 2019

Final Report Abstract

Das Q-Exactive Massenspektrometer wurde nach seiner Inbetriebnahme im Jahr 2015 sofort für die Identifikation von Proteinen eingesetzt, welche mit den neuen modifizierten Basen 5-Hydroxymethylcytidin und 5-Formylcytidin interagieren. Darüber hinaus wurden Proteine gesucht, die mit den wichtigsten Enzymen interagieren, welche DNA-Methylierung und nachfolgend die Oxidationen zu diesen beiden Basen vornehmen. Auf diese Art und Weise sollte charakterisiert werden, welche Proteine am schreiben, lesen und löschen der neuen DNA-Modifikationen beteiligt sind. Ziel der Projekte war es, ein tieferes Verständnis über die Funktion des sogenannten „zweiten Codes“ in der DNA zu erhalten. So konnte zunächst bereits 2015 in einer Kooperationsarbeit mit Elisabeth Binder und Dr. Rein vom Max-Planck-Institut für Psychiatrie in München die Bindung des Proteins FKBP51 an Dnmt1 charakterisiert werden. In einer internationalen Kooperationsarbeit mit den Professoren Vermeulen und Lister wurde das Gerät eingesetzt, um die aktive Demethylierung an sogenannten genetischen Enhancern nachzuweisen. Enhancer sind DNA-Regionen, welche die Transkription bestimmter Gene sehr stark verstärken können. Die Demethylierung von Enhancern führt daher zu einer starken Zunahme der Transkriptionstätigkeit. In eigenen Arbeiten wurde in den Folgejahren das Gerät eingesetzt zur Charakterisierung von RNA- und DNA-Strängen, welche modifizierte Basen beinhalteten. Da sehr häufig mit isotopenmarkierten Basen gearbeitet wird, wurden hierzu vor allem die hochauflösenden Eigenschaften des Gerätes ausgenutzt. So konnten auch Basen unterschieden werden, die nur geringfügige Massendifferenzen aufweisen. In einer Kooperation mit der Arbeitsgruppe Sattler von der TU München gelang es auf diese Weise isotopenmarkierte Inosinbasen in komplexen RNA-Strukturen zu charakterisieren. Das Gerät wurde hierbei eingesetzt zur Charakterisierung der unverdauten Gesamt-RNA. In einer ganz ähnlichen Arbeit wurde der Frage nachgegangen, in wie weit die modifizierte Base m 6dA im Genom höherer Eukaryoten vorkommt. Es gab eine Reihe von Arbeiten, die behaupteten, dass neben den modifizierten Cytidinbasen auch das m6dA eine neue epigenetische Base z. B. in Mäusegenomen ist. Aufgrund der hochauflösenden Eigenschaften des Gerätes und aufgrund der außergewöhnlichen Sensitivität gelang es uns zu zeigen, dass diese Aussagen falsch sind. Die konkurrierenden Gruppen sind aufgrund schlechterer Massenspektrometrieausrüstung hierbei Artefakten aufgesessen. Wir konnten die Base m 6dA z. B. nicht in der DNA von Mäusen und schon gar nicht in Stammzell-DNA von Mäusen nachweisen. Die Arbeiten an m6-modifizierten Adenosiden wurden anschließend in einer Kooperation mit den Arbeitsgruppen Vermeulen und Stunnenberg auf RNA ausgedehnt. Es besteht kein Zweifel, dass in RNA m6A eine ganz wichtige Base ist, eine sogenannte posttranslationale Modifikation. Während vor unseren Arbeiten vor allem Proteine gefunden wurden, die an m 6A in RNA binden, sogenannte YTA Proteine, gelang es uns erstmals in der Kooperation auch solche Proteine zu identifizieren, die von m 6A abgestoßen werden. Die genaue Charakterisierung der Reader-Proteine und der Repeller-Proteine an m 6A führte zu einem umfassenden Verständnis wie m 6A die Homöostase von RNA beeinflusst. In einer ausgesprochen komplexen Arbeit sind wir der Frage nachgegangen, ob 5-Formylcytidin als Base im Genom auch unter Spaltung der C-C-Bindung direkt zu Desoxycytidin umgewandelt werden kann. Ein solcher Schritt wäre die Basis für einen aktiven Demethylierungsprozess. Das Gerät wurde hierzu umfänglichst eingesetzt. Mit Hilfe des Einbaus isotopenmarkierter und fluormarkierter 5-Formylcytidin-Derivate in Stammzell-DANN, sowie nachfolgende Isolation der DNA und Analyse der Folgeprodukte gelang es uns zu zeigen, dass ein solcher C-C-Bindungsbruch in der Tat möglich ist. In all diesen Arbeiten ist uns immer wieder aufgefallen, dass vor allen Dingen die Quantifizierung von Peptiden im Rahmen von Proteomics-Experimenten mit Hilfe von TMT-Reagenzien sehr fehleranfällig ist. Wir haben deshalb mit den Möglichkeiten des neuen Geräts ein neues Projekt begonnen mit dem Ziel neue, bessere TMT-Reagenzien zu entwickeln. In einer kürzlich erschienenen Arbeit haben wir die ersten Reagenzien vorgestellt. In der Tat zeigen sie gerade im Bereich des complementary TMT wesentlich verbesserte Eigenschaften. Zu guter letzt sei erwähnt, dass das Gerät auch aufgrund seiner hochauflösenden Eigenschaften geholfen hat, neue präbiotische Wege zu den Purinbasen zu finden. Hierbei wurde das Gerät eingesetzt zur Analyse komplexer Gemische, die aus sogenannten Eintopfreaktionen entstehen, in denen die Bedingungen der frühen Erde simuliert werden. Mit Hilfe des Gerätes konnte eine neue, präbiotisch relevante Purinsynthese gefunden werden, die unser Verständnis wie der genetische Code und damit das Leben auf der Erde entstanden sein könnte ganz wesentlich erweitert hat.

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