Höchstauflösungsmikroskop (Superresolution)
Final Report Abstract
Die Höchstauflösungsmikroskopie (HRM) zählt zu den innovativsten und einflussreichsten technischen Fortschritten in den bildgebenden Verfahren der biomedizinischen Grundlagenforschung der letzten Jahre. Durch Schließung der Auflösungslücke zwischen klassischer Weitfeld- / Konfokalmikroskopie sowie der Elektronenmikroskopie ist sie u.a. hervorragend für die Untersuchung von Pathogen-Wirt Interaktionen im zellbiologischen Kontext geeignet. Um die Arbeit mit Infektionserregern zu ermöglichen wurde das HRM unmittelbar in einem S2 Infektionslabor unter den entsprechenden Sicherheitsbedingungen etabliert. Nach erfolgreicher Inbetriebnahme und Integration der HRM in die Arbeitsprozesse der Laborumgebung konnten in einer ersten Studie die molekularen Veränderungen an nukleären Porenproteinen im Rahmen des Influenzavirus Replikationszyklus visualisiert werden. Diese Alterationen an den Kernporen sind relevant beim vRNP Import / Export und werden von den Viren gezielt verändert. In einer weiteren Studie konnte die Interaktion zwischen Legionella pneumophila und Mitochondrien im Rahmen der Regulation der „Legionella containing vacuole“ nachgewiesen werden. Der ebenfalls intrazelluläre Infektionszyklus der Bakterien findet auf engstem Raum statt, so dass hier mittels klassischen konfokalmikroskopischen Verfahren bzw. Weitfeld plus Dekonvolution keine ausreichende Auflösung und Differenzierung der zytoplasmatischen Strukturen erreicht werden konnte. Hier trug das HRM ebenfalls entscheidend zum Publikationserfolg bei. Weitere Studien im Rahmen des SFB-TR84 adressieren die Alteration von Mitochondrien unter Infektion mit Streptococcus pneumoniae, welche besonders durch ‚fission‘ und ‚fusion‘ Vorgänge sowie Abrundungen und Elongationen deutliche Hinweise auf ihren Zustand geben. Durch die Infektion kommt es zu starkem Calcium Influx und nach weiteren Prozessen zur Freisetzung mitochondrialer DNA, welche immunaktivierend wirkt. Die hierbei stattfindenden morpholgischen Veränderungen sind besonders gut durch HRM zu visualisieren. Die erreichte Auflösung bei Nutzung von strukturierter Beleuchtung (SIM) war sehr gut um entsprechende Alterationen quantitativ-bildanalytisch und statistisch relevant auszuwerten. Gegenwärtig werden die bildanalytischen Verfahren für die HRM von Mitochondrien mittels Machine / Deep Learning weiterentwickelt und in einer nächsten Studie publiziert. Da es höchst wünschenswert ist, neben der räumlichen Auflösung ebenfalls die zeitliche Auflösung in die HRM einzubeziehen, fokussieren wir aktuell auf die Weiterentwicklung von SIM für die Langzeit-Lebendzellanalyse. Diese ist aufgrund der bislang erforderlichen hohen Laserleistung in hohem Maße photo- und zelltoxisch und damit (noch nicht geeignet) längere Infektionszyklen von Pathogenen in Interaktion mit Organellen zu untersuchen. Mittels Techniken wie PALM / STORM erzielt man in diesem Zusammenhang keine relevanten Ergebnisse, jedoch ist insbesondere SIM eine sehr geeignete Technologie für die HRM-Lebenzellmikroskopie, welche auf Basis des erhaltenen Systems in 2019 aller Voraussicht nach in weiteren Projekten erfolgreich etabliert werden kann. Neben den inhaltlichen Aspekten mit Bezug zu konkreten Projekten war und ist es dem betreibenden Labor ein Anliegen, die Ausbildung Studierender und PostDocs im Bereich der Mikroskopie zu unterstützen. Dafür wurde das HRM im bereits zweiten internationalen Workshop für „Advanced Microscopy“ im Rahmen der internationalen Konferenz des SFB-TR84 im Jahr 2016 eingesetzt. Life-Demos in den relevanten Techniken am HRM sowie Vorträge zum Thema Höchstauflösung durch Experten fanden statt, ebenso wie Hands-on Sessions unter Betreuung von Applikationsspezialisten. Ein nächster mehrtägiger Workshop ist für 2020 in Planung.
Publications
- Influenza virus-induced caspase-dependent enlargement of nuclear pores promotes nuclear export of viral ribonucleoprotein complexes. J Virol. 2015 Jun;89(11):6009-21
Mühlbauer D, Dzieciolowski J, Hardt M, Hocke A, Schierhorn KL, Mostafa A, Müller C, Wisskirchen C, Herold S, Wolff T, Ziebuhr J, Pleschka S
(See online at https://doi.org/10.1128/JVI.03531-14) - IFNs Modify the Proteome of Legionella-Containing Vacuoles and Restrict Infection Via IRG1-Derived Itaconic Acid. PLoS Pathog. 2016 Feb 1;12(2):e1005408
Naujoks J, Tabeling C, Dill BD, Hoffmann C, Brown AS, Kunze M, Kempa S, Peter A, Mollenkopf HJ, Dorhoi A, Kershaw O, Gruber AD, Sander LE, Witzenrath M, Herold S, Nerlich A, Hocke AC, van Driel I, Suttorp N, Bedoui S, Hilbi H, Trost M, Opitz B
(See online at https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005408) - Pneumolysin induced mitochondrial dysfunction leads to release of mitochondrial DNA. Sci Rep. 2018 Jan 9;8(1):182
Nerlich A, Mieth M, Letsiou E, Fatykhova D, Zscheppang K, Imai-Matsushima A, Meyer TF, Paasch L, Mitchell TJ, Tönnies M, Bauer TT, Schneider P, Neudecker J, Rückert JC, Eggeling S, Schimek M, Witzenrath M, Suttorp N, Hippenstiel S, Hocke AC
(See online at https://doi.org/10.1038/s41598-017-18468-7)
