C-Mannosylierung von Tryptophanresten - Charakterisierung der Säugetierenzyme und Untersuchungen zu funktionellen und strukturellen Aspekten der Modifikation von Thombospondin Typ 1 repeats

• Antragsteller: Dr. Hendrikus Hans Bakker
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 263740516

Die C-Mannosylierung von WXXW Motiven in Proteinen stellt eine besondere Form der Glykosylierung dar, die typischerweise auf sogenannten Thrombospondin Typ 1 repeats und Typ I Zytokinrezeptoren vorkommt. Durch die kürzlich erfolgte Identifizierung von C. elegans DPY-19 als C-Mannosyltransferase konnten wir zeigen, dass die C- Mannosylierung und die N-Glykosylierung sich nicht nur hinsichtlich ihrer Mechanismen ähneln, sondern dass auch die zugrundeliegenden Enzyme, die C-Mannosyltransferase und die Oligosaccharyltransferase (das Enzym, das N-Glykosylierungen katalysiert), strukturell verwandte Proteine sind. Während in C. elegans DPY-19 nur in einer Form vorkommt, existieren in Säugetieren vier DPY-19-Homologe (DPY19L1 - 4). Von großer Bedeutung für diesen Antrag ist die Tatsache, dass Mutationen im menschlichen DPY19L2 als Hauptursache für Globozoospermie, eine seltene Form der Infertilität beim Mann, identifiziert wurden. Das hier vorgelegte Projekt umfasst zwei Teilbereiche. Im ersten Experimentalblock steht die Charakterisierung des C. elegans Enzyms und die Aufklärung von funktionellen und strukturellen Konsequenzen, die die durch C-Mannosylierung ergeben, im Vordergrund. Als Akzeptoren werden hier bereits identifizierte Kandidaten genutzt. Da die C. elegans Mutante dpy-19 temperatursensitiv ist, werden funktionelle Studien ganz wesentlich die temperaturabhängige Proteinfaltung und Thermostabilität unterschiedlich mannosylierter Proteine berücksichtigen. Ein weiteres Ziel in diesem Teilprojekt ist die Etablierung von Protokollen zur Aufreinigung und Trennung von mannosylierten und nicht-mannosylierten Thrombospondin repeats, wie sie für spätere Strukturanalysen benötigt werden. In Teilprojekt 2 werden die vier im Säuger identifizierten DPY19-Homologen kloniert und in ihrer Funktion charakterisiert. Die putativen C-Mannosyltransferasen werden aus der Maus kloniert und in C-Mannosyltransferase-negativen Drosophila S2 Zellen exprimiert. Enzymaktivität wird in vitro mit Hilfe synthetischer Peptide und in vivo durch Koexpression mit putativen Akzeptoren bestimmt. Als Akzeptoren stehen unterschiedliche Typen von bekannten C-mannosylierten Proteinen und ein potenziell durch DPY19L2 mannosyliertes Spermaprotein zur Auswahl.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Beteiligte Personen: Professor Dr. Falk Büttner; Professor Dr. Dietmar J. Manstein