Automatisierte Selektionsplattform
Final Report Abstract
Im Jahr 2015 wurden an der Universität Bonn Komponenten zum Aufbau einer vollautomatisierten Selektionsplattform angeschafft. Die Plattform besteht aus einer automatischen Pipettiereinheit mit 8 Pipettierköpfen, die auch einzeln ansteuerbar sind, sowie zahlreichen weiteren Komponenten (diverse Inkubatoren, PCR Maschine, Mikrotiterplattenreader, Durchflusszytometer und einem Lagerhotel zur Aufbewahrung von Plastikware). Diese Ausstattung erlaubt es, äußerst komplexe und mehrstufige molekularbiologische Prozesse, wie zum Beispiel den SELEX Prozess, vollständig zu automatisieren. In den Jahren 2015 bis 2017 wurden die Einzelkomponenten der Plattform zusammengesetzt und auf einander abgestimmt. Im Rahmen dieser Abstimmung erfolgte die Programmierung von SELEX-Protokollen, der manuellen Vortestung ‚automatisierungskompatibler‘ SELEX Verfahren und deren extensive Testung auf der Plattform. Seit 2018 können auf der Plattform routinemäßig vollautomatisierte Selektionen von RNA und 2‘-Desoxy-2‘-Fluoro Pyrimidin RNA Aptameren für Proteine und seit 2019 auch für niedermolekularen Substanzen als Zielmoleküle durchgeführt werden. Für letztere wurde das so genannte Capture-SELEX Verfahren auf der Plattform etabliert. Im Rahmen der Etablierungsphase waren unter anderem umfangreiche Adaptionen der -20°C Einheit notwendig, um deren Dauerbetrieb (>50h) zu ermöglichen. Hierzu mussten Lösungen und Ausführungen entwickelt werden, die eine Vereisung der Oberfläche verhindert. In ihrer derzeitigen Ausführungsform kann die Plattform Selektionen für acht Zielmoleküle parallel durchführen, wobei max. 12 Selektionszyklen ohne manueller Intervention möglich sind. Die Plattform benötigt dafür ca. 43 h-50 h, abhängig davon ob RNA oder 2‘-Desoxy-2‘-Fluoro Pyrimidin RNA als Bibliothek verwandt wird. Die Plattform ist in ihrer Ausführungsform derzeit europaweit einzigartig. Sie stellt inzwischen das Kernelement des Zentrums für Aptamer Forschung und Entwicklung (Center of Aptamer Research & Development, CARD), welches derzeit an der Universität Bonn aufgebaut wird, dar. In diesem Kontext werden die verfügbaren Selektionsprotokolle konsequent erweitert, um auch eine vollautomatische Selektion von DNA und chemisch modifizierten DNA Aptamere sowie die Verwendung von komplexen Zielstrukturen (Zellen) als Zielmoleküle zu ermöglicht. Im Berichtszeitraum wurden bereits Selektionen von RNA und 2’-Desoxy-2’Fluoro RNA Aptameren für unterschiedliche Zielproteinklassen mit Hilfe der automatisierten Selektionsplattform durchgeführt, darunter Antikörper, Hydrolasen (Lysozym), Kinasen (Erk, CDK9), Chemokine (CCL17), Photorezeptorproteine, Liposomen und Adaptorproteine (Cofilin 1 und 2, sowie ADF-1). Darüber hinaus wurden Selektionen für eine Reihe niedermolekularer Substanzen durchgeführt (Neomycin, Kanamycin und cAMP).
Publications
- 2018. RNA aptamers recognizing murine CCL17 inhibit T cell chemotaxis and reduce contact hypersensitivity in vivo. Mol Ther 26, 95-104
Fülle, L., Steiner, N., Funke, M., Gondorf, F., Pfeiffer, F., Siegl, J., Opitz, F.V., Haßel, S.K., Erazo, A.B., Schanz, O., Stunden, H.J., Blank, M., Gröber, C., Händler, K., Beyer, M., Weighardt, H., Latz, E., Schultze, J.L., Mayer, G. and Förster, I.
(See online at https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.10.005) - Robotic assisted generation of 2′-deoxy-2′-fluoro-modified RNA aptamers – High performance enabling strategies in aptamer selection. Methods 2019, 161, Pages 3-9
Breuers S., Lledo Bryant L., Legen T., and Mayer G.
(See online at https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2019.05.022)
