New protein kinase A and G-dependent signaling pathways and networks in the regulation of platelet activation
Final Report Abstract
Die primäre Zielsetzung dieses Projekts war, das Proteinkinase A (PKA) und G (PKG)-abhängige Signalnetzwerk in humanen Thrombozyten in Bezug auf die funktionelle Inhibition besser zu verstehen. Das Arbeitspaket 1 fokussierte sich auf die gemeinsamen PKA- und PKG-Substrate α-Endosulfin (ENSA) und ARPP19. Die thrombozytäre Regulierung und Funktion der ENSA S67/S109 und der ARPP19 S62/S104 Phosphorylierungen konnte erfolgreich aufgeklärt werden. Zudem wurde eine Verbindung zum MASTL-ENSA/ARPP19-PP2A System aufgezeigt, welches bisher nur als Zellzyklus-regulatorisches System in kernhaltigen Zellen bekannt war. Da die Rolle der Ser/Thr Proteinphosphatase PP2A und deren Regulation in Thrombozyten bisher so gut wie nicht bekannt war, tragen diese Ergebnisse erstmals zu möglichen Mechanismen zur PP2A Hemmung und Aktivierung durch differenzierte Phosphorylierungen von ENSA und ARPP19 bei. Dies könnte für die Pathophysiologie von Erkrankungen mit dysregulierter PP2A-Aktivität in Thrombozyten relevant sein. Somit birgt das [MASTL-like]-ENSA/ARPP19-PP2A System in Thrombozyten ein großes Potential als diagnostisches Markersystem der Pathogenese von Entzündungs-, Autoimmun- und Krebserkrankungen. Im Rahmen des Arbeitspakets 2 wurden umfangreiche MS-basierte Phosphoproteomstudien mit verschiedenen Stimuli (und deren Kombination) durchgeführt, primär um Unterschiede in den PKA und PKG Signalwegen zu identifizieren. Diese Arbeiten lieferten die bisher umfangreichsten und komplexesten Daten zur Regulation humaner Thrombozyten mit mehr als 10.000 quantifizierten Phosphorylierungsstellen, insgesamt 17 verschiedenen Stimulationen bzw. Zuständen sowie einer Referenz-Spektrenbibiothek mit hochaufgelösten und markierungsfreien MS/MS Spektren von über 11.000 Phosphorylierungsstellen. Die Ergebnisse und Rohdaten wurden bzw. werden bei Veröffentlichung komplett über das PRIDE Repository mit der Wissenschaftsgemeinschaft geteilt und stellen somit eine nach- und reichhaltige Quelle v.a. für die Thromboyzten- aber auch die PKA/PKG Forschung dar. Zudem konnte ein neuer PKA und PKG-abhängiger Signalweg in humanen Thrombozyten identifiziert werden, der zu einer Verminderung der Syk S297 Phosphorylierung führt, die durch Thrombozytenaktivierung hochreguliert wird. Diese wichtige regulatorische Syk Phoshorylierungsstelle soll in einem weiterführenden Projekt näher charakterisiert werden und stellt ein großes Potential für die Entwicklung von neuen, evtl. auch zell-spezifischen Syk- Inhibitoren dar. Umfangreiche Funktionsuntersuchungen humaner Thrombozyten erweitern zudem bisherige Beobachtungen, dass PKA und PKG auch in Ca2+-unabhängigen Signalwegen involviert sind. Für 37 ausgewählte Phosphorylierungsstellen wurden sogenannte Parallel Reaction Monitoring (PRM) Assays, welche stabil-isotopenmarkierte Standards (SIS) der endogenen Phosphopeptide verwenden, entwickelt. Dies erlaubt es, die Konzentration dieser 37 Phosphorylierungsstellen präzise innerhalb einer LC-MS Messung zu quantifizieren. Die entwickelten PRM Assays können unabhängig von diesem Projekt auch zukünftig zur gezielten Analyse von PKA/PKG Signaling in Thrombozyten (oder anderen Proben) verwendet werden. Mittels der PRM Assays sollen Zeitverläufe spezifischer PKA/PKG regulierter Phosphorylierungsstellen in Thrombozyten präzise quantifiziert werden, um schliesslich das systembiologische Modellieren des PKA/PKG Signallings in Thrombozyten zu erleichtern.
Publications
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