Probing temporal sequences and molecular mechanisms of transcription initiation by single molecule fluorescence microscopy in living eukaryotic cells
Biophysics
Final Report Abstract
Die Transkription eines Gens, das Überschreiben der Information der DNS in RNS, wird durch Binden eines Transkriptionsfaktors an eine spezifische Bindestelle in der Nähe des Gens gestartet. Zusätzlich binden weitere Kofaktoren, und es kommt zum Zusammenbau der Transkriptionsmaschine, die die RNS produziert. Die Bindung der beteiligten Moleküle an DNS und untereinander ist sehr dynamisch. Wie genau die zeitliche Koordination zwischen den Molekülen aussieht, und wie sich die Zeit, die ein Transkriptionsfaktor an DNS bindet, auf die Effizienz der Transkriptionsinitiation auswirkt, ist nicht bekannt. In diesem Projekt wurden zunächst Mikroskopiemethoden entwickelt um kinetische Parameter eines Transkriptionsfaktors, wie die Bindezeit an DNS oder den Prozentsatz der DNS-gebundenen Moleküle, bestimmen zu können. Dafür werden fluoreszent markierte Transkriptionsfaktoren im Zellkern mit einem Mikroskop, das sensitiv genug ist um einzelne Moleküle detektieren zu können, stroboskopartig beleuchtet. Anschließend wurden Transkriptionsfaktoren hergestellt, die die Transkriptionsinitiation hemmen und sich nur durch ihre DNS-Bindezeit voneinander unterscheiden. Mit diesen Transkriptionsfaktoren konnte gezeigt werden, dass die DNS-Bindezeit ein regulatorischer Faktor der Transkription ist. Je länger ein hemmender Transkriptionsfaktor an DNS bindet, desto effektiver verhindert er das Binden des aktivierenden Transkriptionsfaktors, und desto weniger RNS kann produziert werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass nach einem Signal, das die Transkriptionstätigkeit in der Zelle aktiviert, ein Transkriptionsfaktor länger spezifisch an DNS bindet und der Prozentsatz gebundener Transkriptionsfaktoren zunimmt. Die Dauer unspezifischer Wechselwirkungen mit DNS dagegen ist entscheidend dafür, wie schnell ein Transkriptionsfaktor seine spezifische Bindestelle findet. Eine faszinierende Frage im Zusammenhang mit der Transkription ist, wie Embryonen, die zu Beginn ihrer Entwicklung auf Proteine und RNA der Mutter zurückgreifen und noch keine eigene Transkription durchführen, erstmals ihre Transkription starten. Um dies zu untersuchen, wurde die Wechselwirkung mit DNS des basalen Transkriptionsfaktors TBP, der Teil der Transkriptionsmaschine ist, während der frühen Entwicklung in Zebrabärblingembryonen charakterisiert. Es zeigte sich, das TBP am Anfang der Embryonalentwicklung nur zu einem kleinen Prozentsatz an DNS gebunden ist. Mit fortschreitender Entwicklung erhöht sich dieser Prozentsatz, was den Beginn der Transkriptionstätigkeit unterstützt. Verantwortlich für das vermehrte Binden des TBP ist unter anderem, dass sich während der frühen Embryonalentwicklung die Zellen nur teilen, ohne dabei zu wachsen, sie werden daher kleiner. Damit verkleinert sich auch der Zellkern, so dass die darin enthaltene DNS und Transkriptionsfaktoren konzentriert werden. Dies verschiebt das Gleichgewicht hin zum DNS-gebundenen Zustand.
Publications
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