Skeletal Muscle Function under Pressure Elucidating Mechanisms of Muscle Ca2+ Signaling Failure and Ultrastructure Disintegration using a novel High-Pressure Multiphoton Microscopy Technology
Medical Physics, Biomedical Technology
Cell Biology
Final Report Abstract
Im Fokus des Projektes stand die Problematik hoher hydrostatischer Drücke und deren Einfluss auf Integrität und Funktionalität lebender Zellen und Gewebe. Anwendungen hierzu sind beispielsweise die Untersuchung von Mechanismen der Druck-Adaptation von Tiefsee-Organismen oder Druck- Expositions-Grenzen für terrestrische Organismen. Die Kenntnis der prinzipiellen Druckgrenzen unterschiedlicher Organe ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis von Expositionsgrenzen unterschiedlicher Spezies. Jedoch stellen sich Druckexpositionen lebender Gewebe und gleichzeitige Erhebung biologischer Daten als recht schwierig dar und sind häufig technologisch nicht durch kommerzielle Geräte abgebildet. Hierbei steht zum einen im Raum, das Volumen für einen Druckübertrag möglichst gering zu halten und ferner, möglichst minimal-invasive Erhebungen unter hohen Drücken von Geweben und Zellen durchzuführen, am besten unter zu Hilfenahme optische Technologien. Zentrale Aufgabenstellung war es daher, im vorliegenden Projekt eine neuartige Hochdruck-Sichtzellen-Technologie zu entwickeln, welche hochauflösende 3D Mikroskopie mit Laseranregung (z.B. Konfokal- oder Multiphotonen-Mikroskopie) erlauben sollte und dabei das Problem geringer Arbeitsabstände bei symmetrischen Objektiv-Konfigurationen (Multiphotonen-Mikroskopie) lösen sollte. Da hohe hydrostatische Drücke für die Untersuchung von Geweben/Zellen bis ca. 200 MPa (entspricht 2.000 Atmosphären) stabil gehalten werden sollten, waren hier Material- und Maschinenbau-wissenschaftliche Probleme der Dichtigkeit und der Inklusion von Teiloptiken in das Stahl-Gehäuse zu lösen. Das anvisierte Design der von uns genannten PiezoGRIN Technik beinhaltete ein modulares Stahl-Gerüst zweier Mantel- Konfigurationen mit einer zentralen Probenkammer, welche an einen externen Druckerzeuger angeschlossen werden und dicht verschraubt werden konnte. Dichtigkeit wurde zum einen durch PTFE (Teflon) Materialien, zum anderen durch intelligentes Design einer inneren Poulter-Dichtung sowie Verteilung des Druckes nebst Stahlwände auf die eingefassten GRIN-Linsen. Diese GRIN- Linsen agieren als symmetrische Stablinsen, welche die Anregung eines Laserstrahls über ein externes Objektiv in der Hochdruckzelle in das Probenvolumen fokussieren. Hierbei kann der z-Trieb des externen Objektivs weiterhin ausgenutzt werden, eine 3D-fokale Anregung im Probenvolumen zur 3D-Visualisierung zu erreichen. Mit unserem System war es in der Folge sogar möglich, nichtlineare Second Harmonic Generation (SHG) Mikroskopie, welche optische Obertöne in lebenden Geweben induziert, die wir spektral auflösen können, zu erfassen. Diese SHG Eigenschaft ist insbesondere eine nicht-lineare Polarisierbarkeit bestimmter Materialein, so auch Myosin-II und Kollagen-I Moleküle, welche beide in Skelettmuskel-Gewebe vorkommen. In Muskelzellen bildet die regelmäßige Abfolge von Myosin und Aktin Molekülen eine Querstreifung, welche wir ohne Notwendigkeit äußerer Farbstoffe nun auch unter hohen hydrostatischen Drücken untersuchen konnten. Insbesondere die Frage, ob hohe Drücke bis 200 MPa die Integrität der Querstreifung durch Destabilisierung der Zellarchitektur beeinträchtigen können, wurde von uns beantwortet. Obgleich die Zytoarchitektur durch hohe Drücke in fixierten Einzel-Muskelzellen stabil blieb, wurde in Gewebe-Stücken von Muskeln der Maus durch bereits relativ niedrige Drücke von ca. 30 MPa (~300 m) eine irreversible Kontraktur induziert. Um das PiezoGRIN System für subzelluläre Ca2+ Fluoreszenz-Messungen vorzubereiten, war ein weiterer Bestandteil des Projektes die Untersuchung physiko-chemischer Eigenschaften von Nachweis-Indikatoren für Ca2+ Ionen, welche im Skelettmuskel eine Hauptrolle bei der Initiierung der Kontraktion spielen. Hierzu muss man sich vor Augen halten, daß Ca2+ Ionen in Zellen an viele Proteine der Zelle binden können, ebenso an von außen eingebrachte Nachweis-Moleküle (z.B. die Farbstoffe Fluo-4 oder Fura-Red). Die Bindung von Ca2+ an ein Nachweismolekül gleicht einer Puffer-Reaktion, einer reversiblen Bindung, welche von Umgebungsvariablen wie pH, Temperatur und auch Druck abhängt, aber für Letztere überhaupt nicht bekannt ist. Hierzu haben wir die Druckabhängigkeiten der Ca2+-Bindung an Farbstoff-Moleküle im Detail untersucht und die Fluoreszenz-Intensitäten jeweils auf Einflüsse der Bindung durch druckbedingte pH und Ca2+-Ionenkonzentrationsänderungen modelliert. Mit unserer „Korrektur-Matrix“ ist es in der Folge nun möglich, verlässlich Ca2+ Signale unter hohen Drücken in lebenden Zellen zu untersuchen. Neben der wissenschaftlichen Anwendung soll unser PiezoGRIN System nun auch für eine kommerzielle Vermarktung vorbereitet werden.
Publications
- (2019) PiezoGRIN: A High-Pressure Chamber Incorporating GRIN Lenses for High-Resolution 3D-Microscopy of living Cells and Tissues. Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany) 6 (4) 1801453
Schneidereit, Dominik; Schürmann, Sebastian; Friedrich, Oliver
(See online at https://doi.org/10.1002/advs.201801453) - (2016) Calcium sensitive fluorescent dyes Fluo-4 and Fura Red under pressure: behaviour of fluorescence and buffer properties under hydrostatic pressures up to 200 MPa. PLoS One. 11(10), e0164509
Schneidereit D, Vass H, Reischl B, Allen RJ, Friedrich O
(See online at https://doi.org/10.1371/journal.pone.0164509) - (2017) A radiant GRIN at high pressure: utilizing gradient index lenses to enable multiphoton microscopy at hydrostatic pressure up to 200 MPa. 55th European High Pressure Research Group Meeting 3- 8 Sept 2017, Poznan, Poland, P65
Schneidereit D, Schürmann S, Friedrich O
- (2018) Optical prediction of single muscle fiber force production using a combined biomechatronics and second harmonic generation imaging approach. Light Sci Appl
Schneidereit D, Nübler S, Prölß G, Reischl B, Schürmann S, Müller OJ, Friedrich O
(See online at https://doi.org/10.1038/s41377-018-0080-3)
