Charakterisierung des intra- und interzellulären Transports sowie der Lokalisierung von ARGONAUTE-Proteinen

• Antragsteller: Dr. Jochen Gohlke
• Fachliche Zuordnung: Genetik und Genomik der Pflanzen
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2016
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 254981177

Chromatin-Modifikationen stellen einen bedeutenden Mechanismus im Hinblick auf die Regulation der Genexpression dar. So ist beispielsweise eine korrekte Erhaltung und Modifikation von DNA-Methylierungen essenziell für diverse regulatorische Prozesse und Antworten auf Umwelteinflüsse. Die Induktion von DNA-Methylierungen durch ARGONAUTE (AGO)-gebundene siRNAs kann hierbei als ein Schlüsselkonzept der gezielten Modifikation von DNA angesehen werden. Solch gezielte Modifikationen durch DNA-Methylierung sind wichtig für eine generationsübergreifende Genexpressions-Hemmung als Antwort auf externe Signale. An eben jenen Modifikationen sind AGO-Proteine beteiligt, da sie siRNAs binden und die an der Genexpressions-Hemmung beteiligten Proteine zu entsprechenden DNA-Sequenzen im Zellkern leiten können. SiRNAs sind mobil und haben eine systemische Wirkung, jedoch ist über die genauen Mechanismen des siRNA-Transports bisher wenig bekannt. Trotz der systemischen Funktionen und der Notwendigkeit eines Transports durch das Cytoplasma ist der Großteil der Kenntnisse über RNA-abhängige Methylierung auf den Zellkern beschränkt. Da AGO-Proteine häufig cytoplasmatisch lokalisiert sind und siRNAs binden können wäre es denkbar, dass sie an der Rezeption oder am Transport von siRNA-Signalen beteiligt sind.Um die Funktion cytoplasmatischer AGO-Proteine an den oben erwähnten Prozessen aufzuschlüsseln, sind Pfropfungsexperimente mit verschiedenen Arabidopsis-Ökotypen und -Mutanten geplant. Anschließend werden aus den Pflanzenwurzeln Gesamt- und AGO-gebundene siRNAs isoliert. Mittels Hochdurchsatz-Sequenzierung können mit Hilfe von Einzelnukleotid-Polymorphismen mobile RNAs identifiziert werden. Anhand des Verhältnisses mobiler RNAs in der Fraktion der gesamt-siRNAs gegenüber der AGO-gebundenen Fraktion wird es so möglich sein, Rückschlüsse auf AGO-Funktionen in der Rezeption oder beim Transport von siRNAs zu ziehen. Mit Hilfe von Fusionsproteinen und Mutationen soll die Anreicherung von AGO-Proteinen im Cytoplasma oder im Zellkern kontrolliert werden, um ein besseres Verständnis für die biologische Rolle der AGO-Lokalisierung zu gewinnen. Die Fluoreszenz-Mikroskopie transient cotransformierter AGO-Proteine mit einem anderen Zellkern-lokalisierten Protein wird dabei inter- und intrazellulären AGO-Transport aufzeigen.Zur Analyse von AGO-Funktionen in der systemischen Genexpressionshemmung wird ein Transgen-System verwendet, welches in Kombination mit Pfropfungsexperimenten eine fluoreszenzmikroskopische Bewertung systemischer Antworten in AGO-Mutanten erlaubt. So wird es möglich sein, genauere Informationen über die Funktion und Lokalisation von AGO-Proteinen in der Rezeption und Weiterleitung systemischer Signale zu erlangen. Insgesamt werden diese Experimente neue Erkenntnisse über den lokalen und systemischen RNA-Transport liefern und neue Funktionen von Komponenten aufdecken, welche an der transkriptionellen Genexpressions-Hemmung beteiligt sind.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeberin: Professorin Rebecca Mosher, Ph.D.