Proteindesign und Stammentwicklung für die Ganzzell-Biokatalyse mittels Pyrrolochinolinchinon (PQQ)-abhängiger Oxidoreduktasen

• Antragsteller: Dr. Janosch Klebensberger
• Fachliche Zuordnung: Bioverfahrenstechnik ; Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 254226746

Durch die Arbeiten des vorliegenden Antrags sollen Pyrrolochinolinchinon (PQQ)-abhängige Oxidoreduktasen als neue Enzyme für die biotechnologische Ganzzell-Katalyse etabliert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, wird ein synthetischer und periplasmatischer Stoffwechselweg für die Herstellung von Glyoxylsäure, einer biotechnologisch relevanten Vorläuferchemikalie für die Synthese verschiedener Agrochemikalien und Polymeren, auf Basis der Metabolisierung von Ethylenglykol durch modifizierte PQQ-abhängige Oxidoreduktasen konstruiert. Der Modelorganismus Pseudomonas putida KT2440 stellt für diese Aufgabe eine ideale Plattform dar. Dies liegt unter anderem daran, dass der Stamm das für das Projekt notwendige PQQ-abhängige Oxidationssystem bereits besitzt, vielfältige, genetische Werkzeuge zur Verfügung stehen, und der Organismus für seine Widerstandsfähigkeit gegenüber lebensfeindlichen Umweltbedingungen bekannt ist. Robuste Biokatalysatoren sind vor allem bei solchen Biotransformationen von Bedeutung, bei denen sowohl Substrate - wie beispielsweise Alkohole - als auch Produkte oder Reaktionsintermediate - wie beispielsweise Aldehyde oder Säuren - für die Zellen eine toxische Wirkung besitzen. Die zusätzliche Verwendung PQQ-abhängiger Alkoholdehydrogenasen stellt in dem vorliegenden Antrag eine weitere, intelligente Möglichkeit dar, die möglichen toxischen Effekte für die Zelle zu limitieren. Grund hierfür ist die Tatsache, dass diese Enzyme, im Gegensatz zu anderen cytoplasmatischen Alkoholdehydrogenasen, innerhalb des Periplasma lokalisiert sind. Durch die Verwendung des speziellen Cofaktors PQQ, welcher die Elektronen aus der irreversiblen Oxidationsreaktion direkt in die Atmungskette einschleust, entfällt zudem die Notwendigkeit eines spezifischen Regenerationssystems, welches für NAD(P)H oder FADH-abhängige Enzyme notwendig ist.Für die erfolgreiche Etablierung eines neuen Ganzzell-Biokatalysators sind grundlegende Erkenntnisse über konkurrierende Enzymreaktionen, die genetische Stabilität des Wirtes, detaillierte biochemische Daten, sowie Informationen über die molekularbiologischen Ursachen für Substratselektivitäten der verwendenden Enzyme von größter Bedeutung. Durch die vorgeschlagenen experimentellen Ansätze aus biochemischen und physiologischen Studien, genetischen und systembiologischen Methoden, und dem gezielten Protein Engineering, wird die vorliegende Arbeit nicht nur neue und interessante Erkenntnisse über die Regulation und Funktion von PQQ-abhängigen Oxidationssystemen in Pseudomonaden liefern, sondern zudem auch einen neuen und vielversprechenden Biokatalysator für die Biotechnologie bereitstellen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen