Bewegung der c-Untereinheiten in der H+-ATPsynthase aus E. coli bei ATP-Synthese und ATP-Hydrolyse (Zusatzantrag: Immobilisierung und Fluoreszenzmarkierung der H+-ATPsynthase aus E. coli mit Quantum dots)
Final Report Abstract
H+-ATPsynthasen sind membranintegrierte Enzyme, die das energiereiche ATP aus ADP und anorganischen Phosphat herstellen durch Kopplung eines transmembranen Protonenflusses mit der chemischen Reaktion. In dieser Arbeit wird der katalytische Mechanismus des Enzyms untersucht. Ausgangspunkt der Untersuchungen ist die Hypothese, dass der transmembrane Protonentransport zu einer Rotation des Komplexes aus den γεc10- Untereinheiten (Rotor) relativ zu den anderen Untereinheiten α3β3δab2 (Stator) führt. Dadurch werden die Konformationen der katalytischen Bindungstellen schrittweise geändert, so dass die Bindung von ADP und Phosphat, Synthese von ATP und schließlich Abgabe von ATP ermöglicht wird. In früheren Arbeiten haben wir mit Hilfe des Fluoreszenz Resonanz Energie Transfers (FRET) an einzelnen Enzymmolekülen gezeigt, dass sich sowohl die γ- als auch die ε-Untereinheit relativ zu den b-Untereinheiten in 1200-Schritten bei der Katalyse drehen. In dieser Arbeit wurden biochemische Verfahren entwickelt, die es erlauben einzelne Untereinheiten zu isolieren, diese selektiv mit Fluoreszenzfarbstoffen zu markieren und daraus eine in Liposomenmembranen eingebaute H+-ATPsynthase zu assemblieren, die nach Erzeugung einer transmembranen pH-Differenz ATP synthetisiert. Diese Proteoliposomen diffundieren durch das konfokale Volumen der Apparatur zur Einzelmoleküldetektion und es wird die Fluoreszenz von Donor und Akzeptor einzelner Enzyme gemessen und die FRET Effizienz berechnet. Aus der FRET Effizienz und deren Änderung werden an Hand der Förster Theorie die Abstände und Abstandsänderungen bei der Katalyse zwischen Donor an der c-Untereinheit des Rotors und dem Akzeptor an der b-Untereinheit des Stators berechnet. Die gemessenen Abstandsänderungen werden mit den aus einem Homologiemodell der H+-ATPsynthase berechneten Abstandsänderungen verglichen. Es ergab sich, dass die c-Untereinheit in 360 Schritten relativ zu der b-Untereinheit rotiert. Es können 1200 Schritte und 720 Schritte ausgeschlossen werden. Im Rahmen der Fehlergrenzen sind die Messungen auch mit 300 Schritten verträglich, die sich ergeben, wenn man ein Modell des Enzyms mit 12 c-Untereinheiten verwendet. Die entwickelte Methode erlaubt es auch die Bewegung der c-Untereinheiten relativ zur ε-Untereinheit zu untersuchen. Die hierbei gemessenen Abstandsänderungen sind in Übereinstimmung mit einem Modell, bei dem die c-Untereinheiten sich in 360-Schritten relativ zu der ε-Untereinheit bewegen und danach die ε- Untereinheit einen 1200 Schritt ausführt. Der Befund bedeutet, dass die Bewegung der c- Untereinheiten zur Verdrillung der γ- und ε-Untereinheiten führen. Die dabei gespeicherte Energie kann dann in einem 1200 Schritt auf die α3β3-Untereinheiten übertragen werden, wo sie die Konformationsänderungen bewirken können, die für Synthese von ATP notwendig sind.
