Applicability, efficacy and safety of targeted vehicle mediated in vivo base editing in a mouse model of hereditary hemochromatosis type I
Final Report Abstract
Für viele hereditäre metabolische Lebererkrankungen steht zur definitiven Behandlung ausschließlich die Leberorgantransplantation zur Verfügung. Für ausgewählte Indikationen werden derzeit Gentherapieverfahren mit viralen Vektoren in klinischen Studien entwickelt. Bei diesen Verfahren werden zumeist normale Kopien eines defekten Gens durch virale Vektoren in die Leberzellen eingebracht und exprimiert. Ein alternatives Behandlungskonzept nutzt "Designernukleasen" in Kombination mit homologer Rekombination zur gezielten Genmodifikation/-augmentation mit dem Ziel, den Krankheitsphänotyp zu korrigieren. Das biologische Prinzip beruht auf einer gezielten Aufspaltung der Zielregion und dem Einbringen einer „gesunden“ Gensequenz durch homologe Rekombination. Zunächst haben wir in unserem Fah(-/-)-Tiermodell untersucht, ob eine Genkorrektur im Fah(-/-)-Lokus ausschließlich durch Einbringen der "gesunden" Gensequenz in die Leberzellen möglich ist. Serielle Transplantationen der so behandelten Hepatozyten konnte allerdings keine gezielte und stabile Genkorrektur erreichen trotz eines hohen Selektionsdrucks für genkorrigierte Hepatozyten. Wurde die Donorsequenz mit homologen Sequenzen für den Ziellokus im Genom kombiniert und in die Leber eingebracht, konnte eine stabile Korrektur des Zielgenes erreicht werden, aufgrund der Zahl der in den seriellen Transplantationen nachweisbaren Hepatozytencluster allerdings in nur geringer Frequenz. Im nächsten Schritt haben wir untersucht, ob die Expression einer Nuklease eine effiziente Genmodifikation in vivo ermöglicht. Aufgrund des sich rasch entwickelnden Forschungsfeldes wurde die CRISPR/Cas9 – Technik als Nuklease der 3. Generation näher untersucht. Zunächst wurden embryonale Fibroblasten von Fah(-/-) - Mäusen gewonnen und durch Überexpression von vier Transkriptionsfaktoren in Hepatozyten re-programmiert (iHeps). Mit mehreren CRISPR/Cas9 – Konstruktion konnte eine homologe Rekombination und Korrektur im Fah-Lokus erreicht werden. Insbesondere ein Konstrukt mit sich selbst spaltender Donorsequenz hat sich hier als hoch effizient erwiesen. Genkorrigierte iHeps wurden anschließend in die Leber von Fah(-/-)-Mäusen transplantiert. Durch den Nachweis der Leberrepopulation durch die iHeps im Empfängertier, der Detektion von genkorrigierten Genomen durch NGS sowie der Expression des Fah-Proteins konnte erstmals der Nachweis einer präzisen Genmodifikation ex vivo erbracht werden. In einem weiteren Schritt haben wir die Frage untersucht, ob auch durch Injektion von viralen Vektoren (AAV8) in die Schwanzvene eine direkte Korrektur des Gendefektes durch CRISPR/Cas9 und homologe Rekombination möglich ist. Aufgrund der Größe des Transgens (~5,7 kb bei optimiertem Konstrukt) wurden von anderen Arbeitsgruppen zwei AAV-Vektoren verwendet, da das Verpackungslimit für AAVs bei ca. 4.7 kb liegt. Unter Verwendung einer AAV-Variante, bei der das Kapsidprotein VP2 deletiert wurde, konnte das übergroße Transgen (~5,7 kb) verpackt und infektiöse Partikel hergestellt werden. Nach Injektion dieses "all in one" Vektors in die Schwanzvene konnte der Gendefekt im Fah-Lokus in vivo gezielt korrigiert werden. Die Genkorrektur konnte durch Nachweis von Fah-Protein+ Hepatozytenclustern und NGS nachgewiesen werden. Durch unsere Untersuchungen konnte ein weiterer Schritt getan werden zur klinischen Anwendung der CRISPR/Cas9-Technik in der Therapie von hereditären Lebererkrankungen. Ein weiteres Manuskript wurde in einer internationalen Fachzeitschrift zur Publikation eingereicht und befindet sich derzeit im Begutachtungsprozess.
Publications
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Homologous recombination mediates stable Fah gene integration and phenotypic correction in a tyrosinaemia mousemodel. World J Hepatol. 2018 Feb 27;10(2):277-286
Junge N, Yuan Q, Vu TH, Krooss S, Bednarski C, Balakrishnan A, Cathomen T, Manns MP, Baumann U, Sharma AD, Ott M
