Molecular analysis of intestinal stem cells in the context of premature aging, chronic inflammation and colorectal carcinogenesis
Final Report Abstract
In der absolvierten Antragsperiode konnten nahezu alle wichtige Vorarbeiten für einen in vivo RNAi Screen an intestinalen Stammzellen im Organoid- ultursystem geleistet werden. In dem geplanten Screen sollen Faktoren identifiziert werden, welche im Kontext von physiologischer und Telomerdysfunktion-induzierter Alterung sowie chronischer Entzündung zu einer Selektion, einem Wachstumsvorteil und einer erhöhten Proliferation Lgr5-positiver Stammzellen führen. Hierzu wurden Mäuse, welche das Lgr5EGFP-IRESS-CreERT2-Knockin Konstrukt tragen, mit unterschiedlichen Modellen wie Telomerase-defizienten mTerc-/- Mäusen kombiniert. Es war möglich aus diesen Modellen intestinale Krypten zu isolieren und eine Organoid-Kultur zu etablieren. Anhand des Selektionsmarkers GFP war es möglich die intestinalen Stammzellen zu isolieren und visualisieren. Mit Hilfe des lentiviralen Delivery-Systems konnten die aus den Stammzellen erwachsenden Organoide infiziert werden, um so die shRNA-basierte Genmanipulation durchzuführen. Bei den Vorversuchen ergaben sich folgende „Unwegsamkeiten" bzw. „Überraschungen": (I) Komplexität der Etablierung von Alterungskohorten und Arbeit mit unterschiedlichen Generationen Telomerase-defizienter Tiere (ausgeglichen durch hohe Expertise der Mitarbeiter der AG Rudolph am FLI). (II) Etablierung der Organoid-Kultur an vorzeitig gealterten G3 mTerc-/- Tieren. (III) Finden eines geeigneten Readouts für den in vivo lentiviralen RNAi Screen.
