Einzelmolekülfluoreszenzmikroskop mit Lichtblatt-Laseranregung
Final Report Abstract
Das Forschungsgroßgerät „Einzelmolekülfluoreszenzmikroskop mit Lichtblatt-Laseranregung“ ermöglicht die Detektion einzelner fluoreszenter Moleküle unterschiedlicher Farbe im Inneren lebender Zellen mit besonders hoher Sensitivität. Dafür werden Fluorophore mit Laserlicht einer bestimmten Wellenlänge angeregt und das von ihnen ausgesandte rotverschobene Fluoreszenzlicht wird detektiert. Indem das anregende Laserlicht in die Form eines dünnen Lichtblatts gebracht wird, kann gezielt eine dünne Schicht der Zelle beleuchtet und störende Hintergrundfluoreszenz minimiert werden. Das Gerät wurde hauptsächlich für die Untersuchung kinetischer Aspekte der Transkription und der dreidimensionalen Anordnung des Chromatin im Zellkern angewandt. Bei der Transkription einer Gensequenz in RNA arbeitet eine Vielzahl unterschiedlicher Biomoleküle zusammen. Besonders wichtig sind Transkriptionsfaktoren, deren Bindung an DNA den Start oder die Blockade der Transkription signalisiert. Transkriptionsfaktoren wechselwirken mit DNA mit einer durchschnittlichen Bindungszeit im Sekundenbereich, die je nach Art des Transkriptionsfaktors variiert. Die DNA-Bindungszeit kann mit dem Einzelmolekülfluoreszenzmikroskop gemessen werden, indem der Transkriptionsfaktor mit einem Fluorophor markiert und seine Bewegung im Zellkern verfolgt wird. Um die Bedeutung der DNA-Bindungszeit für die Transkription zu untersuchen, wurden künstliche Transkriptionsfaktoren hergestellt, die sich nur in ihrer Bindungszeit unterschieden. Es zeigte sich, dass die untersuchten Faktoren die Transkription um so effektiver blockieren konnten, je länger ihre Bindungszeit an DNA war. Die DNA- Bindungszeit hat damit eine regulatorische Funktion. In der Zelle haben sich die unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren daher so entwickelt, dass ihre jeweilige DNA-Bindungszeit ihrer Aufgabe entsprechend kurz oder lang ist. Ein spezieller Transkriptionsfaktor ist CTCF. Dieses Protein ist an der dreidimensionalen Strukturierung des Chromatin beteiligt, indem es hilft, Schlaufen zwischen spezifischen Stellen auf dem Genom auszubilden. Diese DNA-Schlaufen sind unter anderem für die richtige Durchführung der Transkription wichtig. Um zu klären wie zeitlich stabil solche DNA-Schlaufen sein können, wurde die Wechselwirkungszeit des CTCF mit Chromatin mit dem Einzelmolekülfluoreszenzmikroskop gemessen. Zugleich wurden weitere Biomoleküle, die nur in bestimmten Phasen des Zellzyklus gebildet werden, mit weiteren Fluoreszenzfarben markiert, um die Zellzyklusphase bestimmen zu können. Es zeigte sich, dass CTCF zu Beginn eines Zellzyklus sehr lange Wechselwirkungen mit DNA im Minutenbereich eingeht, die DNA-Schlaufen also über Minuten stabil sind. Sie lösen sich während der Replikation der DNA größtenteils auf, bilden sich danach jedoch wieder. Bevor sich die Zelle teilt, lösen sich alle Wechselwirkungen zwischen CTCF und DNA auf. Insgesamt zeigen die Experimente, dass sich einzelne DNA-Schlaufen viele Male während des Zellzyklus bilden und wieder auflösen können, die Chromatinstruktur also während eines Zellzyklus an verschiedene Aufgaben angepasst werden kann.
Publications
- Direct Observation of Cell-Cycle Dependent Interactions between CTCF and Chromatin, Biophys. J. 112, 2051-2055 (2017)
Agarwal, Reisser, Wortmann, Gebhardt
(See online at https://doi.org/10.1016/j.bpj.2017.04.018) - DNA Residence Time is a Regulatory Factor of Transcription Repression, Nucl. Acids Res.
Clauß, Popp, Schulze, Hettich, Reisser, Escoter Torres, Uhlenhaut, Gebhardt
(See online at https://doi.org/10.1093/nar/gkx728)
