Funktion des trimeren Rab7 GEF-Komplexes bei der endolysosomalen Biogenese in Drosophila

• Antragsteller: Professor Dr. Achim Paululat; Professor Dr. Christian Ungermann
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Biochemie und Physiologie der Tiere
• Förderung: Förderung seit 2014
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 248987912

Das endolysosomale System verbindet die Plasmamembran über die Endozytose mit der lysosomalen Proteinabbau- und Recyclingmaschinerie der Zelle. Dabei kontrolliert der endolysosomale Weg sowohl die Integrität der Plasmamembran und die Funktionalität der eingebetteten Membranproteine, aber auch zelluläre Signalkaskaden. Endosomen reifen von frühen zu späten Endosomen. Dies erfordert einen koordinierten Austausch der frühen endosomalen Rab5- durch das späte endosomale Rab7 GTPase als Voraussetzung für die späte Endosomenfusion mit dem Lysosom. Wir konnten zeigen, dass der trimere Drosophila Mon1-Ccz1-Bulli-Komplex als Rab7 Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor (GEF) Rab5 für seine Aktivierung benötigt. Hingegen wird die Bulli-Untereinheit weder für die GEF-Aktivität noch die Rab5 Bindung benötigt. Allerdings führt der Verlust von Bulli zu einer massiven Anhäufung von Rab5 an späten Endosomen, die in bulli Mutanten physiologische Defizite verursacht. Unsere Daten legen eine Rolle von Bulli bei der endosomalen Reifung nahe, indem es entweder den Rab5-GEF hemmt oder das Rab5-GAP (GTPase aktivierendes Protein) rekrutiert, was in beiden Fällen zu einer Akkumulation von membrangebundenem, hyperaktivem Rab5 führt. In diesem Antrag werden wir einen kombinierten in vivo und in vitro Ansatz wählen, um die Funktion des Drosophila Rab7 GEF Komplexes im Detail zu untersuchen. Im Rahmen von Aim 1 werden wir die molekulare Umgebung des Rab7 GEF-Komplexes bestimmen, indem wir in Drosophila- und Insektenzellen nach spezifischen Interaktionen suchen. Mögliche Kandidaten und Stellen werden in Aim 2 und 3 evaluiert. In Aim 2 werden wir uns auf die in vivo Funktion von Bulli konzentrieren, indem wir die Konsequenzen von Rab5 GAP oder GEF Deletionen oder Überexpression auf die Rab5 und Rab7 Lokalisation analysieren, sowohl in Wildtyp als auch in bulli Mutanten, und werden die Rolle neuer Interaktoren klären. In Aim 3 werden wir unser in vitro System nutzen, um (i) zu rekapitulieren, ob wir eine spezifische Rolle von Bulli innerhalb des Rab7 GEF-Komplexes bei der Rab5-abhängigen Rab7-Aktivierung finden, (ii) die Rolle des Rab7 GEF-Komplexes auf die katalytische Aktivität des Rab5 GAP oder GEF zu bestimmen, und (iii) die Rolle neuer Interaktoren und posttranslationaler Modifikationen in GEF- und GAP-Assays zu bestimmen. Schließlich wollen wir einen möglichen Schaltkreis zwischen Rab5-Inaktivierung und Rab7-Aktivierung mit Hilfe von unterstützten Lipidmembranen rekonstruieren, um zu bestimmen, wie diese Rab-Kaskade im Detail reguliert wird. Wir erwarten, dass diese Analyse die Koordination von EE zu LE und Lysosomenreifung in höheren Zellen aufklärt, eine Voraussetzung für mögliche Eingriffe in die Biomedizin.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen