Hochauflösendes Ionenfallen Massenspektrometer
Final Report Abstract
Das Hochleistungsmassenspektrometer wird vor allem für anspruchsvolle Fragestellungen der Proteinchemie verwendet. Dazu gehören Projekte bei denen das Inventar der Zelle, d.h. die Gesamtheit aller Proteine in bakteriellen Organismen oder humanen Zellen untersucht wird. Hierbei wird zum einen nach den Angriffszielen von bioaktiven Substanzen, oftmals Naturstoffe, gesucht um somit deren Wirkmechanismus aufzuklären. Die Substanzen erhalten dabei durch chemische Synthese einen Marker, der es erlaubt alle an das Zielprotein gebundenen Proteine zu isolieren und über MS/MS Fragmentierung deren Identität aufzuklären. In den letzten drei Jahren wurden dabei über 10 chemische Verbindungen auf ihren Wirkmechanismus untersucht. Um diesen weiter zu analysieren werden Experimente auch mit Gesamtproteomen durchgeführt um herauszufinden welche Proteine durch einen bestimmten Wirkstoff hoch- oder herunterreguliert werden. Beispiele solcher über diese Methode untersuchte bioaktive Verbindungen sind Dynorphin, Spongiolactone, Ramariolide, beta-lactone und andere synthetische Inhibitoren der bakteriellen Virulenz sowie diverse Antibiotika. Für die Identifikation relevanter Proteine ist hierbei vor allem der hohe dynamische Bereich und die Sensitivität des Instrumentes von Nutzen um auch Proteine, die nur in geringer Abundanz vorliegen detektieren zu können. In einem weiteren Anwendungsgebiet wird vor allem das Fragmentierungspotenzial des Gerätes zur Aufklärung posttranslationaler Modifikationen genutzt. Hier konnten neben Nukleotiden und Phosphorylierungen auch viele Kofaktoren analysiert werden, hierzu zählt unter anderem die Identifikation und Lokalisation Pyridoxalphosphat-bindender Stellen in Proteinen. Ausschlaggebend hierfür ist die Aufnahme aller Scans im hochauflösenden Modus und damit verbunden die Genauigkeit und auch Schnelligkeit des Instrumentes. Im Falle von Ampylierungsmodifikationen z.B. wurde die Kombination der Fragmentierungstechniken HCD und ETD genutzt sowie die Möglichkeit Fragmentierungsspektren mit diagnostischen Peaks gezielt mit einer weiteren Fragmentierungsmethode analysieren zu können. Eine weitere Anwendung des Fragmentierungsrepertoires ist die Analyse von Proteinvernetzungen. Diese sogenannten Crosslinks können entweder intrinsischer Bestandteil von Proteinen sein oder gezielt durch chemische Moleküle zum Einfrieren von bestimmten Interaktionen oder Konformationen genutzt werden. Hierbei ließen sich die Kontaktbereiche verschiedener Proteinkomplexe, z.B. der bakteriellen Protease ClpXP sowie durch den Einbau einer unnatürlichen Aminosäure das GFP Proteindimer untersuchen. Insgesamt konnten zentrale Projekte vieler Gruppen der Fakultät sowie Gruppen die dem SFB1035 angehören mit diesem Gerät aufgrund seiner hohen Messgenauigkeit, schnellen Prozessierung der Spektren sowie der Möglichkeit des Fragmentierens erfolgreich abgeschlossen werden.
Publications
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