Molecular basis of giant Extracellular Matrix Binding Protein (Embp) mediated Staphylococcus epidermidis adherence to fibronectin and biofilm accumulation on artificial surfaces
Final Report Abstract
Staphylococcus epidermidis gehört zu den wichtigsten Erregern von Implantat-assoziierten Infektionen. Zentraler Aspekt der Pathogenese ist die Kolonisation von künstlichen Oberflächen in Form von sogenannten Biofilmen. Biofilme werden durch mehrlagig organisierte Bakterienkonsortien ausgeprägt. Für die Entstehung eines Biofilms spielen zwei Aspekte eine überragende funktionelle Rolle: die stabile Bindung des Erregers an eine mit extrazellulären Matrixproteinen (vor allem Fibronektin, Fn) konditionierte Oberfläche, sowie die Produktion einer extrazellulären Matrix, welche zu einer Aggregation einzelner Bakterienzellen führt. S. epidermidis verfügt über ein großes, 1 MDa Oberflächenprotein. Dieses als extracellular matrix binding protein bezeichnete Protein ist sowohl an der Oberflächenbindung wie auch der Bakterieneaggregation beteiligt. Für die Adhärenz an Oberflächen ist die Fn-bindende Aktivität von Embp relevant. Ein wesentliches Ziel dieses Projektes war die funktionelle und strukturelle Charakterisierung der Fn-bindenden Embp Aktivität. Es konnten zwei als F- und FG-repeat bezeichneten Embp Baueinheiten identiziert werden, die wesentliche Bereiche des Proteins repräsentieren. Beide repeats sind durch α-helikale Strukturen gekennzeichnet. Deren Organisation erklärt die mittels small angle X-ray scattering dargestellte, elongierte Embp Architektur. F- und FG-repeats weisen Fn-bindende Aktivität auf. Die Untersuchung der Adhärenz spezifischer S. epidermidis Embp-Mutanten zeigen, dass Unterschiede in den Fn-Bindungskonstanten der beiden repeats in quantitative Unterschiede in der bakteriellen Adhärenz translatieren. Untersuchungen der Embp-vermittelten Bindung von gelöstem oder aber Oberflächen-organisierten Fn unterstreichen die funktionelle Bedeutung sogenannter kryptischer Fn Regionen für die Bindung von Embp. Kryptische Fn Regionen werden im Wesentlichen durch die FNIII Module repräsentiert. In der Tat zeigte sich, dass vor allem FNIII 12 die Bindung von S. epidermidis an beschichtete Oberflächen unterstützt. Die Deletion der FNIII Module in Fn führt zu einer erheblichen Reduktion der Bindungsfähigkeit von S. epidermidis. Die oben beschriebenen, F- und FG-repeats zeigten in Biacore Untersuchungen ebenfalls starke FNIII 12-bindende Aktivität. Mittels Peptid-mapping konnten zwei Peptide innerhalb von FNIII 12 dargestellt werden, welche spezifisch mit F- und FG-repeats interagieren. Die Position dieser Peptide bestätigt die Vermutung, dass Embp über kryptische Fn Regionen an Fn bindet und diese Interaktion daher vom Organisationszustand des Fn abhängig ist. Die Biofilmbildung schützt S. epidermidis vor der Elimination durch das Wirtsimmunsystem und ist daher entscheidend für den chronischen Verlauf einer Implantatinfektion. Ein Ziel des Projektes war es daher, die Interaktion von S. epidermidis und professionellen Phagozyten zu untersuchen. Als wesentliche Erweiterung zu den bisherigen Untersuchungen wurden hierbei (primäre humane Makrophagen, hMacs) eingesetzt und damit ein signifikanter Schritt in Richtung eines infektionsrelevanten experimentellen Settings erreicht. Die Untersuchungen erbrachten unmittelbaren Hinweis darauf, dass die Ausbildung eines Biofilms S. epidermidis vor der Aufnahme durch hMacs schützt. Gleichzeitig führt Biofilmbildung dazu, dass hMacs in einen antiinflammatorischen M2-Phänotyp differenzieren, währende isogene, biofilmnegative Stämme einen proinflammatorische M1-Differenzierung induzieren. Direktes Korrelat dieser Tatsache ist die geringe Expression von il-1β und tnf-α in hMacs nach Kontakt mit biofilmbildenden S. epidermidis, während sich hier eine starke il-10-Produktion fand. Die weiteren Untersuchungen mittels live cell imaging und RNA-Seq zeigten, dass eine mögliche Ursache für die beobachteten Phänomene in einer deutlichen Änderung der dynamischen TLR-2 Präsentation auf der hMacs Oberfläche sowie massive Änderung des TLR-2 Signallings darstellt. Weiterführende Untersuchungen unter Verwendung verschiedener S. epidermidis Biofilm-Mutanten machten deutlich, dass hierfür die spezifische Zusammensetzung der Biofilmmatrix von Bedeutung zu sein scheint. Das Projekt hat sich mit zwei Kernaspekten der Pathogenese von S. epidermidis Infektionen beschäftigt: der Biofilmbildung auf Implantatoberflächen und der Konsequenzen dieses Prozesses für die Interaktion mit professionellen Phagozyten. Hierbei kann gezeigt werden, dass das 1MDa S. epidermidis Oberflächenprotein Embp mittels eines neuen und bislang nicht beschriebenen Mechanismus selektiv an Oberflächen-organisiertes Fn bindet. Biofilmbildung interferiert vermittels von Matrixbestandteilen mit der TLR-2-vermittelten Aktivierung von hMacs und der Phagoszytose. Die gewonnen Erkenntnisse führen zu einem detaillierteren Verständnis der molekularen Pathogenese von S. epidermidis Infektionen und können zukünftig helfen, da Management von Biofilm-assoziierten Infektionen zu optimieren.
Publications
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