Selective hydroxylation of L-proline and derivatives with proline hydroxylases - An approach to reactivity und mechanism
Organic Molecular Chemistry - Synthesis and Characterisation
Final Report Abstract
Im Projekt wird die Enzymklasse der Fe2+/α-Ketoglutarat-abhängigen Hydroxylasen EPR-spektroskopisch beleuchtet. Die Untersuchung der Formation des Reaktions-Komplexes sowie des Reaktionsmechanismus der Hydroxylierung wurden an einer Reihe von ähnlichen Enzymen durchgeführt. Dabei wurde der Einfluss der Anlagerung von Kosubstraten, Substraten und Inhibitoren genauer untersucht. Während in gewöhnlichen Puls-EPR Experimenten kaum Unterschiede der verschiedenen Enzyme detektiert werden konnten, konnten mit komplexeren EPR-Methoden wie ESEEM oder HYSCORE Unterschiede in der Bindung von Reaktionspartnern am aktiven Zentrum aufgezeigt werden. Durch Einsatz von 15N-Histidin-markiertem Enzym konnten vorliegende Stickstoff- Kopplungen aus dem Aminosäure-Rückgrat zum Eisenatom geklärt werden. Zudem erfolgt eine genaue Charakterisierung der Stickstoff-Komplexierung durch die Vergiftung des Enzyms mit Stickstoffmonoxid. Der direkte Vergleich einer Prolin- und einer Pipecolinsäure-Hydroxylase lies Rückschlüsse auf die zweite Koordinationsphäre des Eisens zu. Hierbei wurde für pilzliche Enzyme zum ersten Mal eine Änderung der Geometrie des aktiven Zentrums nach Substratzugabe nachgewiesen. Des Weiteren konnte weiterhin die direkte Nähe eines Substrat-Moleküls zum Eisenzentrum durch 13C-Markierung nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse können in Zukunft die Aufklärung der genauen Ausrichtung der Substrate zum aktiven Zentrum ermöglichen. Die spektroskopische Analyse des Prolin-Pipecolinsäure-Systems kann als Paradebeispiel für die ganze Enzymklasse dienen, wie Regio- und Stereoselektivität moduliert werden. Zusätzlich konnte in einem weiteren Projekt nachgewiesen werden, dass Deferasirox in Anwesenheit des Enzyms JMJD2A nicht als Eisen-Chelator fungiert und das Eisenatom aus dem aktiven Zentrum extrahiert, sondern als Inhibitor daran komplexiert.
Publications
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