Inverses Forschungsmikroskop mit STED-Modul
Final Report Abstract
Ziel des Großgeräte-Paketantrags „STED/RESOLFT“ war die technische Prototyp-Entwicklung einer komplementären Superresolution-Imaging-Plattform, welche die Stärken und Schwächen zweier „targeted imaging"-Systeme für möglichst flexible Anwendungen in primären Herzzellen und Geweben erschließt. Wie beantragt wurde ein STED-Prototyp (STimulated Emission Depletion) erworben und in der Pilotprojekt-Kollaboration mit dem Hersteller erweitert. Parallel wurde wie geplant ein modulares RESOLFT-Entwicklersystem (REversible Saturable Optical Linear Fluorescence Transitions) angeschafft und in Kollaboration mit dem Hersteller (Biotech-Ausgründung) für Mehrfarben-Anwendungen technisch entwickelt. Die entstandende Nutzer-Plattform bietet einerseits die hohe Auflösung und Bild-Geschwindigkeit von STED, andererseits geringe Phototoxizität durch die sehr niedrige Lichtenergie von RESOLFT, und wie geplant wurden die komplementären Gerätesysteme integriert. Der STED-Prototyp und geplante Applikationen wurde zunächst in Pilotstudien für stabile und effiziente 1-, 2- und 3-Farben STED-Anwendungen für kardiale Zell- und Gewebe-Proben entwickelt. Dies beinhaltete auch eine Geräte-Modifizierung und die Überwindung vieler technischer Probleme in kleinen Schritten, eigene teils Geräte-spezifische oder teils veröffentlichte Applikationsentwicklungen, und die weiterführende konzeptionelle Entwicklung für den Einsatz als Nutzer-Plattform „hochauflösende Mikroskopie“ innerhalb eines neuen Service-Projekts im Rahmen des SFB 1002 „Modulatory Units in Heart Failure“. Das STED-Großgerät wurde für die Erforschung charakteristischer intrazellulärer Membran- und Protein-Strukturen eingesetzt, welche die elektromechanische Kopplung („EC-coupling“) in kleinsten Reaktionsräumen vermitteln (sog. Nanodomänen). In Herzmuskelzellen kommen EC-coupling-Nanodomänen in relativ großer Zahl vor (schätzungsweise 20.000). Andererseits kommt es bei vielen Herzerkrankungen zu pathophysiologisch bedeutsamen EC-coupling-Nanodomänen-Veränderungen, die zellbiologisch unvollständig verstanden sind. Die STED/RESOLFT-Plattform hat entscheidend durch hochauflösende bildgebende Untersuchungen von subzellulären Strukturen zum Beispiel von komplexen Ryanodin-Rezeptor (RyR2)/Ca2+-Freisetzungskanal-Clustern jeweils in atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten zu neuen Einsichten über lokale Struktur-Funktionsbeziehungen und zu neuen EC- coupling-Modellen und Modellierungsansätzen intrazellulärer Calcium-Nanodomänen beigetragen. Zusätzlich konnten erstmals signifikante morphologische Unterschiede des intakten transversal-axialen Tubuli-Membraninvagination-Systems (TATS) zwischen atrialen und ventrikulären Herzmuskelzellen durch STED-Mikroskopie in lebenden Kardiomyozyten identifiziert werden. Parallel wurde der STED-Prototyp für intrazelluläre Struktur-Untersuchungen in interventionellen Mausmodellen mit progredienten Herzerkrankungen eingesetzt. Dabei wurden Krankheitsmodelle über funktionelle Veränderungen von Membran-lokalisierten Signaldomänen durch STED-Kolokalisationsanalysen überprüft. Systematisch wurden verschiedene Membran-Domänen auf ihre räumliche und molekulare Spezialisierung in Bezug auf deren Protein- und Lipid-Zusammensetzung analysiert, zum Beispiel wurden Caveolin-Isoformen, verschiedene Ionenkanäle und Cholesterol-haltige Domänen in lebenden und fixierten Proben quantitativ untersucht. Schließlich wurden in translationalen Projekten immunhistologische Untersuchungen humaner Herz-Biopsien mittels STED-Mikroskopie sowie STED-Markierungsstrategien von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in zellulären Signaldomänen mit neu entwickelten hochaffinen fluoreszenten Liganden etabliert. Der durch das Großgeräte-Pilotprojekt erreichte STED-Prototyp leistet, im Berichtszeitraum aber auch prospektiv gesehen, wie erhofft einen entscheidenen Beitrag für die hochauflösende kardiale Bildgebung und seit 2017 in speziellen Imaging-Räumen des Herzforschungszentrums Göttingen.
Publications
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