Konfokales Einzelmolekülfluoreszenzmikroskop mit alternierender gepulster Laseranregung und Multiparameter Fluoreszenz
Final Report Abstract
Zunächst wurde der entwickelte Aufbau genau untersucht und charkterisiert, insbesondere mit Bezug auf die Anwendungen in quantitativen Einzelmolekül FRET Messungen. Dabei wurde untersucht, wie man instrumentelle Korrekturfaktoren die für quantitative Messungen benötigt mit höchster Präzession bestimmt. Der Schwerpunkt der biologischen Forschungstätigkeiten, für die das Gerät eingesetzt wurde, lag auf der Fragestellung, wie die Struktur von Chromatin die Transkriptionsaktivität beeinflusst. In Chromatin wird die DNA gemeinsam mit Strukturproteinen (Histone) kondensiert um das Genom im Zellkern zu organisieren. Das sogenannte Nukleosom stellt die kleinste Einheit von Chromatin dar und seine Struktur und Stabilität haben daher großen Einfluss auf die Zugänglichkeit der DNA und damit auf die Genaktivität. Posttranslationale Modifikationen von Histonproteinen beeinflussen die Stabilität dieser dynamischen Strukturen erheblich. Der kumulative Effekt von Mehrfachazetylierung eines Histons wurde in mehreren Studien untersucht und vermindert die intrinsische Stabilität der Nukleosomen. Der Einfluss einzelner Aminosäuren auf die Nukleosomenstabilität ist jedoch weitgehend ungeklärt. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Dr. Robert Schneider (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg) wurden in unserem Labor Untersuchungen von Nukleosomen durchgeführt, die eine Azetylierung an einer einzigen Aminosäure trugen, nämlich Lysin 64 auf Histon H3 (H3K64). Zur Quantifizierung der Stabilität wurde ein FRET-Assay verwendet, der in unserem und anderen Labors häufig zur Untersuchung von Nukleosomen Anwendung findet Die Untersuchung beruht auf der Tatsache, dass Nukleosomen – abhängig von ihrer intrinsischen Stabilität – bei erhöhten Salzkonzentrationen zerfallen. Nukleosomen mit und ohne der genannten Azetylierung wurden auf einer DNA assembliert, die mit Donor und Akzeptor für FRET-Experimente markiert war. Die Farbstoffpositionen wurden so gewählt, dass intakte Nukleosomen eine hohe und dissoziierte eine niedrige FRET Effizienz aufwiesen. Der Anteil an intakten und zerfallenen Nukleosomen wurde anhand der FRET Effizienz mit Hilfe des beschriebenen PIE-MFD Setups und der PDA-Analyse quantifiziert. Hierbei war die Möglichkeit, Einzelmolekülmessungen durchzuführen und Subpopulationen in der Probe zu unterscheiden von entscheidender Bedeutung. Der Anteil intakter Nukleosomen wurde im Vergleich für H3K64 azetylierte und unveränderte Nukleosomen in Abhängigkeit der Salzkonzentration untersucht. Die posttranslationalen Modifikation führt zu einem destabilisierenden Effekt der untersuchten posttranslationalen Modifikation. Zum Vergleich wurden ähnliche Untersuchungen an Nukleosomen vorgenommen, die an einer anderen Position azetyliert waren (H3K56). Für diese Konstrukte konnte keine Veränderung der salzabhängigen Stabilität gefunden werden, was sich mit den Ergebnissen anderer Studien deckt. Des weiteren wurde der Aufbau verwendet um sm-FRET Messungen an Transkriptionsinitiationskomplexen sowie an anderen Protein-DNA Komplexen durchzuführen. Auch wurden arbeiten zur methodischen Weiterentwicklung von smFRET für strukturbiologische Fragestellungen und zur Aggregation von Proteinen im Rahmen neurodegenerativer Erkrankungen durchgeführt.
Publications
- “Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule FRET and NPS.” Nature Communications
J. Nagy et al.
(See online at https://doi.org/10.1038/ncomms7161) - „Acetylation of histone H3 at lysine 64 regulates nucleosome dynamics and facilitates transcription.” Elife
V. di Cerbo et al.
(See online at https://doi.org/10.7554/eLife.01632) - „Quantitative structural information from single-molecule FRET.” Farraday Discussion
M. Beckers et al.
(See online at https://doi.org/10.1039/C5FD00110B)
