Importance of the D2-domain of coxsackievirus-adenovirus-receptor (CAR) for virus-receptor-interaction of coxsackievriuses
Final Report Abstract
Die Interaktion der Virusoberfläche mit einem zellulären Rezeptor ist hochspezifisch und stellt den ersten Schritt bei einer viralen Infektion dar. Bei Coxsackie-B-Viren (CVB), einer Gruppe humanpathogener Viren, die eine Vielzahl von Krankheiten auslösen können, dient der Coxsackievirus-Adenovirus-Rezeptor (CAR) als zellulärer Rezeptor, um die Zielzelle zu infizieren. CAR besteht aus einem intrazellulären Teil, einer Transmembrandomäne und einem extrazellulären Teil, der in zwei aufeinander folgende Immunglobulin (Ig)-ähnliche Domänen D1 und D2 untergliedert ist. Nach vorherrschender Meinung erfolgt die Interaktion zwischen CAR und dem Viruskapsid durch Bindung an die D1-Domäne. Jedoch ist im Gegensatz zur gut erforschten Funktion der CAR-D1- Domäne bei der Virus-Rezeptor-Interaktion, über die Rolle der D2-Domäne bei CVB-Infektionen nichts bekannt. Untersuchungen mit Adenoviren, denen CAR ebenfalls als Rezeptor dient, zeigten, dass obwohl das Virus primär mit der D1-Domäne interagiert, die D2-Domäne ebenfalls eine essenzielle Funktion bei der Infektion übernimmt. Es war Ziel dieses Projektes zu klären, welche Rolle die CAR-D2-Domäne bei der CVB3-Infektion spielt. Erste Untersuchungen zeigten, dass die Bindung des Virus an die D1-Domäne gestört ist, wenn die D2-Domäne verkleinert oder komplett entfernt wurde. Interessanter Weise war dabei die Virus- Rezeptor-Bindung noch am effizientesten, wenn die D2-Domäne komplett eliminiert war, anstatt nur teilweise deletiert. Weiterführende Analysen ergaben, dass nicht nur die Bindung an CAR ohne D2-Domäne weniger effizient im Vergleich zum Wildtyp-CAR war, sondern auch die Infektion der Zielzellen. Somit kann gesagt werden, dass die CAR-D2-Domäne bei der CVB3-Infektion eine wichtige Rolle spielt, die D1-Domäne allein jedoch ebenfalls Rezeptorfunktionen aufweist, wenn auch mit geringerer Effizienz. Darüber hinaus war es von Interesse, ob die D2-Domäne neben einer möglichen direkten funktionellen Aufgabe, wie die Interaktion mit dem Viruskapsid, eher Bedeutung für die Positionierung und sterische Integrität der D1-Domäne hat. Um dies zu testen, wurde die CAR-D2- Domäne gegen Domänen desselben Typs der gleichen Proteinfamilie ausgetauscht. Nachfolgende Virus-Rezeptor-Bindungsassays und Infektionsexperimente zeigten, dass die Funktion der CAR-D2-Domäne vollständig durch eine andere, ähnliche Domäne ersetzt werden konnte. So wies die Rezeptorchimere CARD1-IgSF11, bestehend aus der D1-Domäne des humanen CAR und der D2-Domäne des Proteins IgSF11, die gleichen Rezeptoreigenschaften wie Wildtyp-CAR auf. Die Experimente zeigten jedoch auch, dass nicht jede der eingesetzten D2-Domänen die Rezeptoreigenschaften im selben Maße wiederherstellen kann. Ausschlaggebend schien dabei die Auswirkung der substituierten D2-Domäne auf die Struktur der D1-Domäne zu sein, da diese eine perfekte Passform benötigt, um mit dem CVB3-Kapsid zu interagieren und so eine Infektion zu ermöglichen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die CAR-D2-Domäne nicht essentiell für die Interaktion zwischen CVB3 und CAR ist, jedoch die strukturelle Integrität und somit Funktionalität der D1-Struktur sichert. CAR verfügt, wie viele Proteine, über Glykosylierungen, eine Modifikation die mitunter eine wichtige Rolle bei der Faltung, Lokalisation und Funktion von Proteinen spielt. In einem dritten Teilprojekt wurde geklärt, inwiefern diese Glykosylierung eine Rolle bei der Virus-Rezeptor-Interaktion spielt. Untersuchungen mit CAR-Mutanten, die keine Glykosylierung der D1-, D2- oder beider Domänen aufwiesen zeigten, dass die Glykosylierung in diesem Fall und im Gegensatz zu Adenoviren, keine Auswirkung auf die Funktion von CAR als CVB3-Rezeptor hat. Daraus ergeben sich vielversprechende neue Optionen für den Einsatz des antiviral therapeutisch wirksamen löslichen CAR (sCAR-Fc) gegen CVB-Infektionen, da unterschiedliche Glykosylierungsmuster von Eu- und Prokaryoten oft ein limitierender Faktor bei der Großproduktion eukaryotischer Proteine in z.B. E. coli sind.
