Analysis of the extracellular matrix of bioengineered tendon tissue by means of MALDI-TOF mass spectrometry and NMR spectroscopy.
Final Report Abstract
Multipotente mesenchymale Stromazellen (MSC) werden, aufgrund ihres therapeutischen Potenzials, zur Behandlung eines breiten Spektrums pathologischer Erkrankungen in der Humanund auch Veterinärmedizin erforscht. Trotz erkennbarer Fortschritte bestehen Defizite hinsichtlich der Charakterisierung des Zelltyps. Plastische Adhärenz, Trilineage-Differenzierungspotential und die Expression bestimmter Oberflächenantigene sind bisher die einzigen Kriterien, die meist in akzeptabler, standardisierter Weise bewertet werden. Die Spezifität dieser Charakterisierungstechniken ist umstritten und der Ansatz der Immunphänotypisierung mit methodischen Schwierigkeiten behaftet, gerade wenn es um vergleichende Charakterisierung von Zellen verschiedener Spezies geht. Defizite bei der Charakterisierung des MSC-Phänotyps erschweren die Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Studien. Im Rahmen des Projekts, vor allem während der zweiten Förderperiode, wurden alternative MSC-Charakterisierungsansätze erarbeitet, die zuverlässig und artenübergreifend eingesetzt werden können. Dazu wurden Aufarbeitungs- und Analysenmethoden etabliert, mit denen es möglich sein wird, MSC mittels LC-(ESI)MS lipidomisch zu phänotypisieren. Humane, equine und canine MSC, isoliert aus Fettgewebe, wurden als Monolayer oder zweidimensional kultiviert. Die Zellen wurden mit verschiedenen Medienzusätzen und/oder auf kollagenbeschichteten Kulturschalen kultiviert. Zum Vergleich wurden mononukleare Zellen aus peripherem Blut (PBMC) und Fibroblastenkulturen analysiert. Um den Einfluss der Kulturbedingungen auf die PL-Fingerabdrücke der MSC zu ermitteln, wurden die Zellen geerntet, die Lipide gemäß des Verfahrens Bligh & Dyer extrahiert und das PL-Profil der einzelnen Kultivierungsansätze mittels LC-MS gemessen. Stress oder oxidative Schädigungen durch die Generierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) bringen Veränderungen der Lipidzusammensetzung von MSC mit sich. Während oxidativer Prozesse kommt es zur Abspaltung des Fettsäurerests an der sn2-Position und damit zur Entstehung von LPC. Massenspektrometrische Untersuchungen unterschiedlich kultivierter MSC, ergaben neben dem PL-Fingerabdruck nur geringe LPC-Ausbeuten. Das deutet darauf hin, dass die analysierten Zellen nur geringem oxidativem Stress ausgesetzt waren oder die MSC stresstoleranter sind. LPC ließ sich, in geringen und vor allem gleichbleibenden Verhältnissen zum PC, in den Lipidextrakten der Zellen nachweisen. Untersuchungen zur de novo Synthese von PL ergaben Unterschiede im Syntheseweg. Es konnte gezeigt werden, dass MSC SM nicht auf einem glukosebasierten Syntheseweg produzieren. Die MSC-Proben wurden anhand ihrer gesamten Phospholipidverteilung sowie ihrer individuellen Fettsäurezusammensetzung untersucht, um ein charakteristisches PL-Muster zu erhalten. Lipidanalytik stützt sich nicht auf artspezifische Marker, da es sich um eine nahezu speziesunabhängige Stoffklasse handelt. PL gehören, direkt gesehen, nicht zum Grundgerüst der ECM. Sie sind allerdings maßgeblich an ihrer Synthese beteiligt. Im Sehnengewebe synthetisieren differenzierte Zellen (Tenocyten) Phospholipide nach einem spezifischen Muster, was im Umkehrschluss auf die Qualität der Zellkultur und damit auf die ECM schließen lässt, deren Grundgerüst hauptsächlich aus Kollagen und GAG besteht, die in einem weiteren Projekt genauer untersucht wurden. Fragmentionen der PL in Form von Kopfgruppen und/oder Fettsäureresten konnten mit den, in der Projektlaufzeit etablierten Methoden, sehr sensitiv detektiert werden. Die Lipidanalytik wurde im Förderzeitraum von Sehnengewebe auf Zellkulturen verschiedener Zelltypen übertragen. Die Ergebnisse der Untersuchungen weisen stark darauf hin, dass die lipidomische MSC-Phänotypisierung ein praktikabler und vielversprechender Ansatz für die MSC-Charakterisierung ist.
Publications
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De novo synthesis of phospholipids and sphingomyelin in multipotent stromal cells - Monitoring studies by mass spectrometry. Chem Phys Lipids, 232 (2020) 104965
Prabutzki, P., Leopold, J., Schubert, S., Schiller, J., Nimptsch, A.
