beta/alpha/beta/beta/beta-Modulproteine in Resistenz und Metabolismus von Pseudomonas aeruginosa
Biochemie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Pseudomonas aeruginosa ist ein Gram-negatives bakterielles Pathogen, das potentiell tödliche Infektionen in immungeschwächten Personen, besonders in Krankenhäusern oder in Mukoviszidosepatienten, auslösen kann. Weil Infektionen mit P. aeruginosa schwer zu behandeln sind und außerdem zunehmend Resistenzen gegen etablierte Antibiotika auftreten, werden neue Antibiotika gegen diesen Krankheitserreger dringend benötigt. P. aeruginosa selbst erzeugt Moleküle mit breiter Toxizität, wie z.B. das blaue Phenazin-Pigment Pyocyanin, das seine Wirkung durch die Induktion von reaktiven Sauerstoffspezies vermittelt. Diese reaktiven Sauerstoffspezies beschädigen das Gewebe des Wirts, wirken gleichzeitig aber auch antibakteriell, so dass P. aeruginosa über Selbstresistenzmechanismen verfügen muss, um sich nicht selbst zu vergiften. In einer vorangehenden Arbeit hatten wir die Struktur eines Resistenzfaktors aus einem anderen Phenazinproduzenten aufgeklärt. Mit dieser Struktur konnten im Genom von P. aeruginosa 22 ähnliche Proteine identifiziert werden, die ebenfalls vier sog. „βαβββ-Module” besitzen. Diese Proteine interagieren üblicherweise mit kleinen Molekülen, wobei sie ihre Substrate in metallabhängigen Reaktionen verändern oder sie einfach mit Hilfe von zwei aromatischen Aminosäureseitenketten durch π-stacking binden. Eine eingehendere Sequenzanalyse zeigt außerdem, dass es daneben eine dritte Klasse gibt, die weder die metallbindenden noch die für die Bindung aromatischer Substanzen erforderlichen aromatischen Aminosäuren besitzt und die in der Literatur bisher nicht beschrieben worden ist. In der hier vorgestellten Arbeit haben wir uns mit der Analyse von 18 bisher nicht charakterisierten βαβββ-Modulproteine aus P. aeruginosa mit strukturbiologischen, biochemischen und mikrobiologischen Methoden beschäftigt. Wir konnten zeigen, dass drei der vier mit aromatischen Aminosäuren in der Ligandenbindungsstelle ausgestatteten Proteine tatsächlich Pyocyanin mit mikromolarer Affinität binden, was auf eine Rolle im Phenazinhaushalt von P. aeruginosa hindeutet. Stämme, in denen nur eins dieser Gene durch Transposonmutagenese deletiert war, zeigten jedoch keine erhöhte Pyocyaninsensitivität, was mit einer funktionellen Redundanz zusammenhängen könnte und derzeit weiter untersucht wird. Das vierte aromatenbindende βαβββ-Modulprotein weist Ähnlichkeit zu einem Bleomycinresistenzprotein aus einem anderen Bakterium auf und führte tatsächlich zu einer erhöhten Resistenz von E. coli gegenüber dieser Verbindung. Für die metallbindenden βαβββ-Modulproteine konnte keine enzymatische Aktivität beobachtet werden, im Rahmen unserer Arbeiten wurden jedoch Kristallstrukturen von einigen Vertretern dieser Gruppe aufgeklärt. Besonders intensiv haben wir uns mit der Untersuchung der Struktur und Funktion der dritten βαβββ-Modulproteinklasse aus P. aeruginosa beschäftigt. So gelang die Kristallisation aller bisher nicht untersuchten Vertreter dieser Klasse, und wir kennen nun die Struktur aller fünf Mitglieder dieser Gruppe. Phänotyp-Analysen von Deletionsmutanten weisen darauf hin, dass diese Proteine in Resistenzmechanismen von P. aeruginosa involviert sind, eine exakte Funktionsbestimmung gelang jedoch nicht. Zusätzlich wurden auch Kristallstrukturen von mehreren cotranskribierten Proteinen aufgeklärt, allerdings ließ sich auch mit diesen Daten keine genauere Eingrenzung der Funktion erreichen. Zusammengenommen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass viele der 22 βαβββ-Modulproteine aus P. aeruginosa einen bisher nicht beachteten Teil des Resistoms dieses wichtigen Pathogens ausbilden.
