Identification of new catalytic and regulative components of purine nucleotide catabolism of Arabidopsis thaliana using a genetic screen.
Final Report Abstract
Das primäre Ziel der geförderten Forschungsarbeiten war, ein besseres Verständnis des Purinnukleotidstoffwechels und im Besonderen des Abbaus der Purinnukleotide in der Modellpflanze Arabidopsis zu gewinnen. Dieses Ziel sollte durch eine genetische Sichtung (screen) erreicht werden. Dazu wurde eine EMS-Mutagenese an Samen der Urat-Oxidase (UOX)-Mutante durchgeführt. Die UOX katalysiert den Abbau von Harnsäure im Katabolismus des Purinrings. In der UOX-Mutante akkumuliert Harnsäure, was verhindert, dass die Pflanze einen Keimling etablieren kann, außer es steht extern Saccharose zur Verfügung. Durch die Mutagenese sollten Suppressorallele identifiziert werden, die die Harnsäureakkumulation im uox-Hintergrund senken oder die physiologische Empfindlichkeit für Harnsäure vermindern. Solche Suppressoren könnten zum Beispiel für Enzyme kodieren, die im Stoffwechsel oberhalb von UOX agieren. Die Sichtung wurde erfolgreich durchgeführt, und insgesamt wurden vier Suppressoren identifiziert. Bei zwei von diesen war die Xanthin-Dehydrogenase (XDH) betroffen, deren Mutante uns bereits im Vorfeld als Suppressor bekannt war. Die anderen beiden Suppressoren konnten durch next generation sequencing im Gen für die Ureidpermease 1 (UPS1) verortet werden. Eine UOX UPS1 T- DNA Doppelmutante zeigte genauso wie die EMS-Mutanten im uox-Hintergrund eine Verminderung der Harnsäureakkulation im Samen und eine teilweise Wiederherstellung der Fähigkeit einen Keimling zu etablieren. Arabidopsis besitzt fünf UPS Gene, wobei UPS3 wahrscheinlich ein Pseudogen ist. Keine der anderen uox ups T-DNA Doppelmutanten zeigte eine Suppression der Harnsäureakkumulation oder konnte einen Keimling etablieren, woraus geschlossen werden kann, dass UPS1 eine nicht-redundante Funktion (im uox-Hintergrund) ausführt. Wir konnten zeigen, dass UPS1 an der Plasmamembran lokalisiert und dass der UPS1-Promoter exklusiv im Vergleich zu den anderen UPS Promotoren in den Kotyledonen des Embryos aktiv ist. Da ein Peroxisomendefekt in den Kotyledonen ursächlich für den uox-Phänotyp ist, passt dieses Expressionsprofil gut zur spezifischen Suppressionswirkung von defekten UPS1-Allelen. Allerdings erklärt sich daraus nicht, warum die Harnsäurekonzentration in Samen mit uox ups1 Hintergrund vermindert ist. UPS Proteine transportieren laut Literatur Allantoin oder Uracil. In T-DNA UPS-Einzelmutanten (UPS1, UPS2, UPS4, UPS5) konnten wir keinen verminderten Allantoin- oder Uracilgehalt im Samen feststellen. Wir vermuten, dass doch eine Redundanz vorliegt, die aber im uox-Hintergrund für UPS1 teilweise maskiert wird. Um dies zu prüfen, erstellen wir im Moment Mehrfachmutanten mit Hilfe eines CRIPR/Cas9-Ansatzes. Kreuzungen von T-DNA Mutanten sind größtenteils nicht möglich, da UPS1, UPS2 und UPS4 eng genetisch gekoppelt sind. Über eine phylogenetische Analyse der UPS-Proteinfamilie in Pflanzen haben wir festgestellt, dass es gerade in den Brassicaceae zu einer Diversifikation der UPS-Transporter gekommen ist, deren funktionelle Bedeutung unklar ist. Ziel unserer abschließenden Arbeiten wird sein, die detaillierte physiologische Rolle des UPS1-Transporters und der UPS-Proteinfamilie in Arabidopsis thaliana zu klären.
Publications
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(2013) Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine de-aminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. Plant Cell 25, 4101-4109
Dahncke K, Witte CP
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(2014). Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. Plant Cell 26: 3090-3100
Hauck OK, Scharnberg J, Medina Escobar N, Wanner G, Giavalisco P, Witte C-P
