Automatisiertes high content Screening Fluoreszenzmikroskop für funktionelle Protein-Messungen in lebenden Zellen (mit FCS/FCCS, FLIM, FRET)
Final Report Abstract
Um die Organisation und das Verhalten von Zellen zu verstehen, werden heute hochempfindliche Mikroskope verwendet, die es erlauben in lebenden Zellen kleinste Strukturen und sogar einzelne Protein zu beobachten. Damit dies möglich ist, wird Fluoreszenzbeleuchtung verwendet und die zu observierenden Strukturen oder Proteine werden mit Markern versehen. Diese Marker werden durch Licht angeregt und können dann nach Abgabe von Fluoreszenzlicht in den lebenden Zellen beobachtete werden. Dadurch kann bestimmt werden wie sich Objekte oder Proteine in den Zellen verteilen und wie sie sich bewegen. Wenn man jetzt aber mehr Information erhalten will, z.B. ob zwei Proteine miteinander interagieren, oder ob ein Protein an einer bestimmten Stelle in der Zelle aktiv ist oder nicht, oder was denn die genaue Funktion einer Struktur ist, müssen spezialisierte Mikroskopie-Methoden verwendet werden. Dazu benötigt man auch spezielle Mikroskope, wie z.B. ein Mikroskop welches mit einer Möglichkeit versehen ist, einzelne Photonen mit einer Zeitauflösung im Pico- Sekundenbereich zu zählen. Damit kann man diverse Messungen machen die alle darauf beruhen, dass das Licht der Fluoreszenzmarker durch die Umgebung und die Bewegung von Proteinen beeinflusst wird, was zu Veränderungen im zeitlichen Verlauf des Fluoreszenzsignales führt. Will man hingegen die Funktion einer Struktur bestimmen, verwendet man häufig die Methode der Laser-Ablation. Dabei wird mittels eine gepulsten UV Lasers sehr lokal in der Zelle eine Schädigung erzeugt, und man kann daraufhin beobachten, wie sich die Zelle verhält. Die ermöglicht Rückschlüsse über die zerstörte Struktur. So werden z.B. in der Arbeitsgruppe von Professor E. Schiebel DNA Reparatur Mechanismen untersucht und wie diese von der Phosphatase Cdc14 reguliert werden, auch unter Verwendung von Laser-Induzierten DNA Schäden. Eine andere Möglichkeit mittels eines Lasers Information zu erhalten stellt die Photokonversion dar. Damit werden sogenannte photoaktivierbare fluoreszierende Proteine mit einem Laser lokal an einer spezifischen Stelle in der Zelle aktiviert. Daraufhin kann man beobachten, wohin die nun fluoreszierenden Protein sich bewegen. Frau Prof. S. Erhardt untersucht mittels solche Methoden wie sich Zentromere von Chromosomen verhalten, wenn sich eine Stammzelle teilt und eine differenzierte Tochterzelle entsteht. In unserer Arbeitsgruppe werden mit solchen MIkroskopen Methoden entwickelt und angewendet, um innerhalb einer Zelle die Interaktionen von Protein zu bestimmen. Dazu wird eine Beobachtung von Proteinen mit sehr hoher Zeitauflösung durchgeführt, in dem man einen Laser an einer bestimmten Stelle in der Zelle positioniert und beobachtet, wie die Protein sich durch den Laserstrahl bewegen. Mittels solcher Fluoreszenzfluktuationen kann man bestimmen, wie viele Protein es gibt, wie schnell sie diffundieren einer Methode die FCS heißt) und ob zwei Proteine miteinander durch die Zelle diffundieren (mit einer Methode, die FCCS heißt). Um aus den beobachteten Fluktuationen diese Informationen zu erhalten, müssen komplexe Berechnungen angestellt unter Verwendung von Modellen die Prozesse beschreiben und die an die Daten angepasst werden. Um diese Modelle besser zu Beschreiben, entwickelt wir neue fluoreszierende Proteine für besondere Anwendungen bei der FCCS Methode entwickelt. Oder es werden Methoden und Software entwickelt, um die FCS/FCCS Methodik zu verbessern, z.B. um die Auflösung von Mikroskopen genau zu messen oder um mittels der sogenannten Fluoreszenz-Lebensdauer die einzelnen Farbstoffe, welche die Fluoreszenz produzieren, besser unterscheiden zu können. Dadurch können die Modelle und Analysemethoden vereinfacht werden und man erhält sehr viel genauere Messungen der Interaktion zweier Proteine. Diese Methoden werden dann dazu verwendet, um die Interaktionen von Proteinen bei der Endozytose zu untersuchen. Ein anderes Projekt befasst sich mit der Stressvermittelten Signalübertragung, z.B. wenn die Zelle einem osmotischen Schock ausgesetzt wird. Mittels FCCS wird dabei untersucht, welche Protein-Protein Interaktionen während der Zellantwort auf den Schock stabil sind, und welche bei der Signalübertragung auseinfallen.
Publications
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