Die Rolle von TNF-alpha und MAP-Kinase p38 für die Entstehung der proteinurischen Nierenschädigung bei Diabetes
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Werden die Vorarbeiten und die im Rahmen dieses Forschungsprojektes erzielten Ergebnisse im Verbund betrachtet, ergibt sich ein möglicher Pathomechanismus für die TNF-α und Glukose-vermittelten Signalwege der proteinurischen Nierenschädigung bei Diabetes, die im folgenden zusammengefasst und schematisch dargestellt werden. Sowohl eine hohe Glukosekonzentration und als auch TNF-α führen in Podozyten zur Phosphorylierung und damit zur Aktivierung der MAP-Kinase p38, das wir in kultivierten humanen und murinen Podozyten zeigen konnten. MAPK p38 phosphoryliert Nephrin am Serin 1146, das wir schrittweise mit in vitro Kinase Asseys mit radioaktivem P32 ermittelt haben. Für diesen Teil des Forschungsprojektes haben wir rekombinante, GST-markierte Nephrin-Fragmente sowie eine nicht phosphorylierbare Nephrin S1146A Mutante hergestellt. Mittels Immunopräzipitationsexpermente in transfizierten HEK 293T konnten wir zeigen, dass der Phosphorylierungsstaus von Serin 1146 für die Bindung von PKCa an Nephrin eine entscheidende Rolle spielt. Wir nehmen daher an, dass diese Aminosäure an der PKCα-Bindungsstelle des Nephrins beteiligt ist. In den bereits 2011 veröffentlichen Ergebnissen hatten wir dargestellt, dass PKCα Nephrin an den Aminosäuren T1120 und T1125 phosphoryliert und so die Bindung an β-Arrestin2 vermittelt. Aufgrund von Experimenten mit kultivierten HEK 293T und murinen Podozyten vermuteten wir schon damals, dass die Bindung von Nephrin an β-Arrestin2 zu dessen Endozytose führt. Im Rahmen dieses Forschungsprojektes entwickelten wir eine gänzlich neue in vivo Methode mittels Biotinperfusion, die Endozytose Vorgänge an der Schlitzmembran in narkotisierten Tieren darzustellen und zu quantifizieren. Dadurch konnten wir zeigen, dass die glomeruläre Schlitzmembran von normoglykämen und diabetischen Mäusen, sowie diabetischen Mäusen, die pharmakologisch behandelt wurden, ein unterschiedliches Nephrin-Verteilungsmuster aufweist. Die diabetischen und albuminurischen Tiere wiesen im Vergleich zu gesunden Kontrollen signifikant weniger Oberflächen-assoziiertes Nephrin auf. Wurde die diabetischen Tiere zusätzlich mit einem p38 Inhibitor behandelt, so verändert sich der Blutzucker zwar nicht, die Albuminausscheidung war aber signifikant rückläufig während gleichzeitig das Oberflächen-assoziiertes Nephrin zunahm. Wir stellen daher abschließend die Hypothese auf, dass die MAP-Kinase p38 durch die Phosphorylierung von Nephrin zur dessen Endozytose führt, bildlich gesprochen eine Undichtigkeit der glomerulären Schlitzmembran bewirkt und zu Albuminurie führt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Nephrologie 2013: „Die Hemmung von TNF-alpha und p38 schützt vor hyperglykämieinduzierter Proteinurie“
Magdalena P. Woznowski, Sebastian A. Potthoff, Anna Tepe, Eva Königshausen, Johannes Stegbauer, Lars C. Rump, Lorenz Sellin und Ivo Quack
- Kidney Week 2013, American Society of Nephrology: “In vivo quantification of nephrin endocytosis mediated by MARK p38 in diabetic animals”
Woznowski, Sebastian A. Potthoff, Eva Königshausen, Johannes Stegbauer, Lars C. Rump, Lorenz Sellin und Ivo Quack
- Kidney Week 2014, American Society of Nephrology: “MAP-Kinase p38 - pivotal mediator of slit diaphragm integrity”
Potthoff, Eva Königshausen, Thorsten Wiech, Johannes Stegbauer, Raphael Haase, Clara Frosch, Lars C. Rump, Lorenz Sellin and Ivo Quack
- A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. PLoS One. 2017 Jun 12;12(6):e0179217
Haase R, Potthoff SA, Meyer-Schwesinger C, Frosch C, Wiech T, Panzer U, Königshausen E, Stegbauer J, Sellin L, Rump LC, Quack I, Woznowski M
(Siehe online unter https://doi.org/10.1371/journal.pone.0179217) - Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins. J Vis Exp. 2019 Jan 18;(143).
Königshausen E, Potthoff SA, Haase R, Meyer-Schwesinger C, Kaufmann E, Rump LC, Stegbauer J, Sellin L, Quack I, Woznowski M
(Siehe online unter https://doi.org/10.3791/58542)
